«Микроскопический метод исследования. Тинкториальные свойства и структура бактерий. Сложные методы окраски. Структура бактериальной клетки. Функциональные методы определения подвижности»

1. Микроскопия как основной и вспомогательный метод исследования в диагностике.

(см.тема 1)

2. Простые методы окраски, техника, оценка.

Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

3. Сложные дифференциальные методы окраски, их виды, назначение.

Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

4. Метод Грама, как главный метод в дифференциации бактерий, его сущность, техника, оценка. Изучение тинкториальных свойств бактерий по методу грама

Техника окраски:

1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым раствором генцианового фиолетового в течение 1-2 минут.

2. Сливают остаток краски, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.

3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96⁰ спиртом (препарат несколько раз помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцвечивание проводят не более 20 – 30 сек.

4. Препарат промывают водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина 1 - 2 минуты.

6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Оценка результатов. Грамположительные бактерии окрашены в темно-фиолетовый или синий цвет, грамотрицательные – в красный или розовый.

5. Метод Циль - Нильсена — способ окраски кислотоустойчивых бактерий окраска кислотоустойчивых микробов м. Tuberculosis методом циль – нильсена

Техника окраски:

1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, не превышающий по размеру предметное стекло.

2. Наливают карболовый фуксин Циля (основной краситель) и осторожно нагревают мазок на горелке/спиртовке 3-5 минут до появления паров, после чего оставляют краситель, пока препарат несколько остынет.

3. Снять бумагу с фуксином и промыть препарат водой.

4. Окрашенный препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) 3-5 сек или смесью 10 частей спирта и 1 части соляной кислоты в течение 1-2 мин или 95 % этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты (HCl), несколько раз погружая предметное стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом, пока мазок на вид не станет бледно-розовый.

5. Препарат тщательно промыть водой.

6. Споласкивают его 96% этиловым спиртом (в лаборатории часто этот этап упускают).

7. Снова ополаскивают водой.

8. Докрашивают 3-5 мин водным раствором метиленового синего Леффлера (дополнительный краситель).

7. Препарат промыть водой, подсушить и микроскопировать.

Оценка результатов. Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые – в сине-голубой.