диссертации / 136

2.2.3.Синдромологический метод

Синдромологический метод – это методическая основа для успешной диагностики наследственной патологии. Выявление признаков, характерных для прогрессирующей мышечной патологии, предусматривает «поэтажное» (сверху вниз) обследование организма пробанда: лицо, голова, шея, плечевой пояс и верхние конечности, грудная клетка, позвоночник, тазовый пояс и нижние конечности.

При обследовании пациентов автор оценивал:

•рост, тип телосложения и наличие асимметрии;

•состояние мышечного тонуса;

•наличие и степень выраженности неврологической симптоматики

(параличей и парезов определенной группы мышц);

•наличие атрофий (проксимального или дистального поражения);

•степень подвижности суставов (угол);

•наличие миопатического феномена и степень его выраженности.

Была составлена анкета – схема протокольного обследования пациентов с

НПМД, состоящая из 11 пунктов, куда были включены вышеописанные признаки,

свидетельствующие об особенностях клинического проявления заболевания

(Приложение 4). Эти признаки отражали вариабельность клинического фенотипа НПМД. С применением данного метода была проведена диагностика НПМД у 216

пациентов.

2.3.Лабораторно-инструментальные методы исследования

2.3.1.Электронейромиографическое исследование

ЭНМГ – является значимым методом ранней диагностики заболевания,

дифференциальной диагностики нервно-мышечной патологии, определения стадии заболевания и активности миодистрофического процесса.

41

Электронейромиография – проводилась пациентам на электромиографе

«Нейромиан» (г. Таганрог) в Медицинском центре «МАКСИМЕД» г. Махачкалы по стандартной методике с использованием накожных и игольчатых электродов.

Основной методикой игольчатой ЭМГ является стандартная игольчатая ЭМГ. В основе стандартной игольчатой электромиографии, наиболее часто применяемой для диагностики заболеваний периферической нервной системы,

лежит изучение двигательных единиц скелетных мышц с помощью концентрического игольчатого электрода, введенного в двигательную точку исследуемой мышцы. Метод позволяет определять функциональное состояние мышцы, наличие или отсутствие текущего процесса в мышце, степень и выраженность денервации, выраженность и эффективность реинервации.

Применялись концентрические игольчатые электроды одинакового диаметра с отводящей поверхностью 0,07мм, но различной длины (от 20 до 60 мм) для использования в различных мышцах.

Стандартная методика исследования ЭМГ, при которой игольчатые электроды вводятся в мышцы, позволяет регистрировать спонтанную активность

(потенциалы фибрилляции, потенциалы фасцикуляции, положительные острые волны, миотонические разряды, псевдомиотонические разряды), изменение параметров потенциалов двигательных единиц (ПДЕ).

Для миопатического типа поражения характерно:

•уменьшение средней длительности и снижение амплитуды ПДЕ;

•повышение фазности потенциалов и выраженная полифазия;

•спонтанная активность регистрируется преимущественно в виде потенциалов фибрилляции.

ЭНМГ исследованию подверглись проведено 216 пациентов.

Все данные ЭНМГ исследований вносились в индивидуальные карты наблюдения пациентов и в базу данных Microsoft Excel.

42

2.3.2. Биохимический метод

Биохимический метод исследования применяли для определения активности фермента креатинфосфокиназы в крови с целью диагностики активности миодистрофического процесса.

Активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе «IMOLA» (производство США)

кинетическим методом.

В основе определения активности КФК лежал колориметрический метод определения неорганического фосфора, освобожденного в результате гидролиза креатинфосфата. Креатинкиназа катализировала обратимую реакцию фосфорилирования креатина. Методика применялась в соответствии с работой Меньшикова В.В. (1987)

Биохимические исследования выполнялись в биохимической лаборатории Республиканской клинической больницы г. Махачкалы. Всего проведено 216

исследований. Результаты КФК в крови оценивали в широком диапазоне от 246

до 31 200 Ед/л.

Необходимо отметить высокие показатели КФК в дебюте заболевания при КППМД и небольшие при ПМДОФ и ПМД с ригидностью позвоночника.

Аналогичные данные получены и другими исследователями (Zhang Y., 2012).

Все полученные результаты вносились в индивидуальные карты наблюдения пациентов и в базу данных Microsoft Excel.

2.3.3. Магнитно-резонансное исследование мышц

МР исследование мышц было использовано для диагностики ПМД, а также для отбора определенных мышц для электрофизиологического исследования и выбора пациентов для молекулярно-генетического исследования.

МР исследование мышц осуществляли на аппарате «GENERAL ELECTRIC HDe 1,5 T», производство США, в Республиканском диагностическом центре г.

43

Махачкала. МРТ обеспечивает высокую контрастность мягких тканей, позволяет оценивать поперечно-полосатые мышцы, их форму и объем (гипотрофии,

гипертрофии), и архитектонику мышечной ткани (Mercuri E., 2005; 2007).

Отмечено, что МРТ обладает высокой чувствительностью в обнаружении дистрофических изменений.

Были получены снимки в дистальных и проксимальных отделах бедер и голеней во фронтальном и сагиттальном срезе. По данным проведенных исследований у 4 пациентов с КППМД в пораженных мышцах выявляли гиперинтенсивный сигнал на Т1 и Т2 взвешенных изображениях, отражающих жировую и соединительнотканную дегенерацию отдельных мышц.

На полученных снимках была выявлена картина атрофических изменений различных групп мышц с замещением соединительнотканной и жировой клетчаткой.

2.3.4. Молекулярно-генетический метод

Молекулярно-генетический метод исследования применяли в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН (руководитель д.б.н. проф. Поляков А.В.), а также в лаборатории генетической службы Научно-практического центра медицинской помощи детям с пороками развития черепно-лицевой области и врожденными заболеваниями нервной системы (руководитель службы – д.м.н.,

проф. Г.Р. Мутовин).

Исследованию на предмет носительства патологических генов подверглись

105 индивидуумов, среди них 23 пациента с клиникой НПМД и 82 их фенотипически здоровых родственников и коренных жителей горного изолята.

Образцы ДНК в отобранной группе обследованных были получены из лейкоцитов периферической крови у 15 пациентов, а также путем соскоба букального эпителия по стандартной методике у 90 пациентов.

ДНК-диагностика проводилась методом полимеразной цепной реакции, в

основе которой лежит циклический синтез in vitro строго заданных ограниченных

44

участков ДНК длиной от несколько десятков до несколько тысяч п.о., которая

включает 3 основных циклических биохимических этапа:

•денатурация двойной спирали ДНК-матрицы при температуре 950 С;

•гибридизация одноцепочечной ДНК-матрицы и праймеров при температуре 45-600С, в процессе которой праймеры распознают комплементарные им участки ДНК-матрицы;

•полимеризация при температуре 60-720С, то есть синтез комплементарной цепи на ДНК-матрице, начинающийся от места гибридизации праймера и происходящий в направлении 5, 3,.

Дальнейший анализ продуктов ПЦР предполагал исследование конкретных особенностей амплифицированного участка гена. Для обнаружения нуклеотидных замен в анализируемом участке гена применяли секвенирование.

Нуклеотидная последовательность ДНК амплифицированного фрагмента гена DYSF выглядела таким образом:

gcggccgccgcccagccaggtgcaaaatgccgtgtcattgGGAGACTCCGCAGCCGGAGcattag

attacagctcgacggagctcgggaagggcggcgggggtggaagatgagcagaagcccctgttctcggaacgccggc

tgacaagcggggtgagcgcagccggggcggGGACCCAGCCTAGCCCACTggagcagccgggggt

ggcccgttcccctttaagagcaactgctc

где красным шрифтом выделены последовательности праймеров,

синим шрифтом выделена амплифицируемая последовательность,

зеленым цветом обозначена область исследуемой мутации.

Всего выполнено 105 анализов на выявление мутаций при различных формах НПМД, из них 98 анализов на мутацию в гене DYSF, по 2 анализа на мутации в генах CALN, LMNA и EMD и 1 анализ на мутацию в гене SEPN.

При этом решались следующие задачи:

1.Диагностики формы НПМД.

2.Оценка частоты встречаемости ПКПМД 2В типа (ОМИМ 253 601).

3.Выявление различных фенотипов при одной генетической мутации в семьях с КП ПМД, в частности 2В типа (ОМИМ 253 601) и дистального типа Миоши (ОМИМ 254 130).

45

4. Определение гетерозиготного носительства КППМД в пределах горного изолята.

По результатам проведенного генетического тестирования был создан специальный регистр обследованных семей из группы риска для дальнейшего их наблюдения и консультирования.

Все результаты молекулярно-генетических исследований в выборках больных с НПМД были внесены в индивидуальные карты пациентов и в базу данных Microsoft Excel.

2.4. Сегрегационный анализ

Сегрегационный анализ проводился для подтверждения наследственного характера заболевания и доказательства соответствия выявленного у пациента заболевания предполагаемому типу наследования. Анализ был направлен на установление сегрегационной частоты с учетом вероятности регистрации.

Для генетического анализа использовались ядерные семьи с размером сибства 2 и более (Гинтер Е.К., 2002; Амелина С.С., 2006).

Вероятность регистрации рассчитывалась по Фишеру (Fisher R.A., 1934).

π = ∑А / ∑R (1)

А = а (а-1)

R = а(r-1), где:

а – число пробандов в сибстве, r – число больных в сибстве.

Значение сегрегационной частоты определялось пробандовым методом

46

2.5. Анализ распространенности НПМД

Значения распространённости наследственных прогрессирующих мышечных дистрофий в Республике Дагестан рассчитывались отдельно для всех типов – аутосомно-доминантного, аутосомно-рецессивного и Х-сцепленного.

Распространенность аутосомно-доминантных и аутосомно-рецессивных ПМД была рассчитана на 100 тыс., а распространенность Х-сцепленными на 100

тыс. мужского населения по формуле:

Стандартная ошибка к выборке рассчитана по формуле:

где n–число больных, N - численность популяции (Животовский Л.А., 1991;

Гинтер Е.К., 2012).

Рассчитаны также общие показатели распространенности для Республики в целом и для каждого района в отдельности.

В ходе генетико-эпидемиологического исследования в Республике Дагестан нами были выделены группы – «город», «равнинная» часть, «предгорная» часть и

«горные» изоляты. Сравнение полученных результатов проводилось с применением t-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при р ≤0,05 (Животовский Л.А., 1991).

47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Наследственная прогрессирующая мышечная дистрофия выявлена у 216

пациентов в 118 семьях. Сбор, регистрацию и исследование материала проводили в течение 5 лет с января 2009 года по декабрь 2013 года по пяти ранее недостаточно изученным нозологическим формам. Их распределение представлено в таблице 2.

Таблица 2. Распределение ПМД по формам.

Как видно из данных таблицы 2, наибольшее количество составляют пациенты с ПМД Ландузи – Дежерина, которая выявлена у 128 пациентов в 62

семьях. КППМД диагностирована у 43 пациентов в 25 семьях, ПМД дистального типа Миоши у 8 пациентов в 4 семьях, ПМД Эмери – Дрейфуса у 27 пациентов в

19 семьях, ПМД ОФ у 5 пациентов в 5 семьях, ПМД с ригидностью позвоночника у 5 пациентов в 3 семьях. В дальнейшем пациенты с КППМД и ПМД дистальным типом Миоши будут рассматриваться в одной группе.

48

3.1.Результаты сегрегационного анализа

Для подтверждения моногенного характера наследования заболеваний и определенного типа наследования проводился сегрегационный анализ.

Сегрегационный анализ проведен отдельно для АР и АД заболеваний. В случаях,

когда предполагался аутосомно-рецессивный тип наследования, соотношение больных и здоровых сибсов в ядерных семьях ожидалось близким или равным 1/4 (25% больных, 75% здоровых), и родители были здоровы.

Сегрегационный анализ семей предположительно с аутосомно-

рецессивным типом наследования.

Сегрегационный анализ проводился для 58 пациентов из 35 семей,

отягощенных НПНМД предположительно с АР типом наследования в два этапа

(Гинтер Е.К., 2006; Зинченко Р.А., 2009).

1 этап – определение вероятности регистрации и доли спорадических случаев;

2 этап – вычисление сегрегационной частоты.

Распределение пациентов по количеству детей в семьях с предположительно АР типом заболеваний показано в таблице 3.

Таблица 3. Распределение больных по сибствам

49

В сегрегационном анализе участвовали сибства размером 2 и больше, то есть 49 пациентов из 26 семей.

Расчет вероятности регистрации и оценка сегрегационной частоты в семьях с предположительно аутосомно-рецессивной патологией проводился с применением данных из таблицы 4.

Таблица 4. Данные для сегрегационного анализа

Примечание: а – число пробандов, r – число больных в семье, s– размер сибства.

Вероятность регистрации для предположительно рецессивных заболеваний рассчитывалась по методу Фишера (Fisher R.A., 1934) и составила

0,78.

=∑A / ∑R; =38 / 49=0,78.

Значения π, когда 0< <1 соответствуют множественной неполной регистрации.

Для оценки сегрегационной частоты po использовался пробандовый метод Вайнберга (Emery A., 1976; Morton N.E., 1959):

po = ∑R / ∑S; po = 49 / 152 = 0,32

Значение 0,32 оказалось выше, чем ожидаемая при аутосомно-рецессивном типе наследования сегрегационная частота 0,25.

50