диссертации / 97

семейство белков SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-fusion-protein attachment protein receptor). При активации нейтрофилов форболовым эфиром PMA (phorbol meristat acetate) представитель семейства SNARE–

белок SNAP-23 транслоцируется на клеточную мембрану. На мембране

SNAP-23 взаимодействует с другим белком синтаксином-6, блокирование антителами этих белков предотвращает дегрануляцию желатиназных гранул

[Martin-Martin et al., 2000]. Также рецептор-опосредованное высвобождение гранул зависит от активации сигнальных молекул, включающих src-

семейство тирозин-киназ, тирозин-фосфатазу MEG2, киназы MARCK, Rab, а

также молекулы Rho GTPase, Rac2 [Lacy and Eitzen, 2008].

Механизмы, лежащие в основе секреции морфологически различных популяций гранул, запускаются в определенной последовательности,

которая, скорее всего, связана с их количественным присутствием в цитозоле. При стимуляции нейтрофилов в первую очередь происходит мобилизация секреторных везикул, затем высвобождение содержимого желатиновых гранул, специфических гранул и, наконец, азурофильных гранул [Cassatella M., 2010] (Рис. 1).

С изменениями из [Cassatella M., 2010].

Рис.1. Характеристика нейтрофильных гранул.

21

1.2.3. Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Еще одним механизмом уничтожения бактерий нейтрофилами является образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET, от neutrophil extracellular traps) [Brinkmann and Zychlinsky, 2007]. При наблюдении за нейтрофилами был описан эффект, при котором активация клеток приводила к высвобождению разветвленных структур волокон, состоящих из деконденсированных ДНК в комплексе с цитозольными белками, белками из гранул и гистонами. По данным масспектрометрии определено не менее 24

различных белков в составе NET [Urban et al., 2009]. Такой комплекс локально обеспечивает достаточно высокую концентрацию антимикробных компонентов, чтобы уничтожить патоген независимо от поглощения. Хотя механизм образования ловушек до конца не изучен, известно, что их образование зависит от активности NADPH-оксидазы [Palmer et al., 2012]. В

то же время супероксид анион-радикал, продуцируемый экзогенно с помощью NADPH-оксидазы, обладает ограниченной пермеабилизирующей способностью и не может убивать бактерию непосредственно [Klebanoff, 1974]. В дополнение к антимикробным свойствам, нейтрофильные внеклеточные ловушки могут создавать барьер, предотвращающий распространение патогена.

1.2.4. Активные формы кислорода в нейтрофилах

Понятие АФК включает в себя соединения, так или иначе связанные с первичным образованием супероксид анион-радикал O2* из кислорода. Как фагоцитирующие лейкоциты, нейтрофилы, помимо потребления кислорода для дыхания, в ответ на соответствующие стимулы генерируют АФК.

Основное количество молекул кислорода потребляется при дыхании в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях для энергетических и катаболических целей, и до 15% кислорода расходуется на

22

образование АФК в процессе нормальной жизнедеятельности клеток

[Vladimirov and Proskurnina, 2009].

Несмотря на то, что АФК играют важную биологическую роль в повышении устойчивости организма к патогенам, широкий спектр патологических состояний обусловлен нарушениями регуляции продукции АФК: как в сторону избыточной генерации АФК и развития окислительного стресса, так и при их дефиците.

АФК регулируют внутриклеточные сигнальные пути, клеточный цикл,

развитие апоптоза [Suzuki et al., 1997]. Высокие концентрации АФК (в

особенности перекись водорода H2O2) обладают способностью ингибировать синтез ДНК и деление клеток, а также могут активировать апоптоз [Halliwell, 2007]. Также АФК влияют на накопление ионов Са2+ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации, главным образом, протеинкиназы С и тирозинкиназ, а также ингибирования протеинфосфатаз [Dubinina, 2001]. Показано, что АФК и липидные радикалы в низких концентрациях индуцируют экспрессию генов (в том числе протоонкогенов) и деление клеток. АФК активируют белки Ras, играющие важную роль в передаче сигналов в ядро клетки [Hole et al., 2010].

Показано, что накопление АФК приводит к активации транскрипционного фактора NF-кВ, индуцирующего синтез ряда цитокинов и рецепторов, участвующих в развитии иммунного и воспалительного ответа

[Morgan and Liu, 2011]. Известно об участии АФК в промежуточных реакциях синтеза гормонов, в том числе эйкозаноидов и иодтиронинов

[Кулинский, 1999].

1.2.4.1. Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах

Продукция АФК в нейтрофилах, как внутриклеточных, так и внеклеточных, находится под упорядоченным контролем инициирующих и ингибирующих компонентов различных рецепторно-опосредованных

23

сигнальных путей. Разнообразные внутриклеточные компоненты координируют работу продуцирующих АФК систем и участвуют в поддержании оптимальных значений АФК.

Главным источником АФК служит реакция одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. В ходе такой реакции образуется первичный радикал – супероксид анион-радикал O2*. В нейтрофилах он образуется преимущественно NADPH-оксидазным комплексом внешней цитоплазматической мембраны, мембран фагосом, в небольшой степени дыхательной цепью внутренней мембраны митохондрий и эндоплазматической системой цитохрома Р-450. Еще одним первичным радикалом является монооксид азота NO, однако его образование контролируют другие ферментные системы – NO-синтетазы. Из-за высокой реактивности O2* быстро переходит в молекулярные продукты. Так, большая часть O2*спонтанно или под действием фермента супероксид дисмутазы

(СОД) превращается в H2O2, малоустойчивую молекулу, которая токсична в больших концентрациях [Babior et al., 1973]:

Цитотоксический эффект O2* и H2O2 связан с их способностью реагировать с продуктами других антимикробных систем и образовывать более агрессивные АФК, таких как гипохлорид HOCl, гидроксил радикал

OH*, синглетный кислород 1O2, озон О3, и др.

Оксидант нерадикальной природы HOCl, который образуется из H2O2

под действием фермента миелопероксидазы, обладает самым сильным антибактериальным и фунгицидным эффектом, однако способность этого соединения самостоятельно разрушать фагоцитированные вещества однозначно не доказана [Arnhold, 2004].

В неблагоприятных для клетки условиях при участии O2* происходит восстановление трехвалентного иона железа до двухвалентного. В качестве

24

донора электорона Fe2+ может вступать в реакцию с H2O2 (реакция Фентона)

или с HOCl с образованием активного окислителя – OH*, обладающего мутагенным и канцерогенным свойствами за счет способности повреждать ДНК [Halliwell, 2007]. В то же время OH* запускает перекисное окисление липидов биологических мембран с образованием липидных радикалов,

которые является хотя и не единственным, но одним из основных источников спонтанной хемилюминесценции клеток [Vladimirov and Proskurnina, 2009].

Вышеописанные представители группы АФК обладают разнообразными свойствами, функциями, и в зависимости от факторов, воздействующих на клетку, их соотношение может меняться.

В нефагоцитирующих клетках АФК являются в основном продуктами работы митохондриальных белков в составе дыхательной цепи мембраны митохондрий, которая является основным поставщиком энергии клетки в форме АТФ. В ходе транспорта электронов по дыхательной цепи 1-2%

электронов «теряются» и участвуют в продукции O2*. Факторы, приводящие к нарушению окислительного потенциала мембраны митохондрий, в

частности, в результате нарушения синтеза белков-переносчиков электронов в дыхательной цепи или блокировании электронно-транспортных путей,

усиливают продукцию O2* [Boveris, 1984]. Поскольку нейтрофилы бедны митохондриями, этот путь генерации АФК вносит значительно мешьший вклад в общую продукцию АФК в этих клетках, по сравнению с другими источниками.

В нейтрофилах основным продуцентом АФК является мембраносвязанный мультимолекулярный ферментный комплекс NADPH-

оксидаза, в меньшей степени ферментные системы СОД и миелопероксидазы. Типичная структура NADPH-оксидазы в нейтрофилах включает в себя несколько субъединиц: две мембранные p22phox

25

(NOX2), три цитозольные p67phox, p47phox, p40phox и низкомолекулярные G-

белки Rac2, Rap1A и Rho [Sheppard et al., 2005].

Существует несколько механизмов регуляции активности NADPH-

оксидазы, и эта регуляция опосредована взаимодействием различных компонентов этого фермента. В покоящихся клетках NADPH-оксидаза существует в диссоциированном состоянии, тогда как при стимуляции нейтрофилов ее компоненты образуют функционально активный комплекс, и

происходит образование O2* [Sheppard et al., 2005].

Активация NADPH-оксидазы происходит при фосфорилировании составляющих фермент белков и транслокации цитозольных компонентов к мембране для полной сборки ферментного комплекса. Считается, что активированная NADPH-оксидаза находится в связанном состоянии с внешней плазматической мембраной или образованной фагосомой, однако описано существование отдельного пула NADPH-оксидазы в везикулярных структурах. Достоверно не установлено, каково происхождение этих образований: внутриклеточное или из внешней мембраны. Образование таких везикул пиноцитозом не объясняет механизм полной сборки в них цитозольных и мембранных компонентов NADPH-оксидазы [Robinson, 2008].

1.2.5. Роль нейтрофилов в патологических процессах

Изменение активности нейтрофилов может быть одним из факторов,

определяющих развитие и прогрессирование патологических процессов.

Ответ нейтрофилов при острых воспалениях и инфекциях всегда предшествует более специфическому лимфоцитарному ответу,

преобладающему при хронических воспалениях и инфекциях. Однако нейтрофилы нельзя рассматривать лишь как маркеры острого воспаления:

описано их участие в развитии заболеваний с хроническим течением воспалительного процесса. Установлены роль и вклад нейтрофилов в патогенезе таких заболеваний, как хронический грануломатоз, различные

26

болезни легких, системные васкулиты, ревматоидный артрит и сердечно-

сосудистые заболевания [Iking-Konert et al., 2008].

Избыточная активация нейтрофилов и накопление АФК описано в патогенезе ряда иммунных заболеваний, онкогенезе [Valko et al., 2006], при нарушениях метаболизма, после ишемии миокарда и головного мозга [Neuzil et al., 2005], при атеросклерозе [Zalba et al., 2005].

Появление в организме антител к ферментам нейтрофилов (протеиназа- 3, миелопероксидаза) приводит к усилению и пролонгации их активации,

избыточной продукции АФК и лизосомальных ферментов, индуцирующих лизис клеток эндотелия, что имеет большое патогенетическое значение при развитии системных васкулитов [Kallenberg, 2011].

Роль нейтрофилов в противоопухолевом иммунитете неоднозначна. С

одной стороны, на начальных этапах развития опухоли нейтрофилы одними из первых мигрируют в область ее формирования, где меняют морфологию и свою функциональную активность [Мальцева, 2007]. В очаге развития опухоли нейтрофилы оказывают цитостатический и цитотоксический эффекты на опухолевые клетки-мишени посредством избыточной продукции АФК [Nathan, 2006], а также независимо от АФК, вероятно, с помощью цитокин-опосредованного механизма [Brú et al., 2009]. С другой стороны,

данные свидетельствует о том, что на поздних этапах опухолевого развития,

нейтрофилы способствуют прогрессии опухолей при участии селектинов и нескольких нейтрофильных ферментов, в частности, металлопротеиназ, а

также цитокинов, стимулирующих ангиогенез и провоцирующих рост и метастазирование опухоли [Tazzyman et al., 2009].

По мере миграции нейтрофилов в ткани в них активируется транскрипция ряда хемокинов, включая IL-8, которые дополнительно привлекают клетки в очаг воспаления [Cassatella et al., 1993; Scapini et al., 2000; Scapini еt al., 2008].

27

Таким образом, нейтрофилы, участвуя в иммунных реакциях организма,

выполняют двойную роль: с одной стороны, они обеспечивают,

антимикробную защиту и клиренс поврежденных тканей, а с другой стороны,

усугубляют воспалительные реакции с повреждающим эффектом,

связанным, в том числе, с продукцией АФК.

1.3.Регуляция активности нейтрофилов

Ворганизме осуществляется негативная регуляция функционирования нейтрофилов, ограничивающая их активность и предотвращающая повреждение тканей при дегрануляции и избыточной продукции АФК нейтрофилами.

Способы защиты от АФК включают в себя химические и ферментативные механизмы. Первый защитный механизм реализуется с участием веществ-антиоксидантов, которые прерывают цепную реакцию окисления. Вступая в реакции со свободными радикалами, они сами превращаются в радикалы, но с меньшей реакционной способностью. К

таким природным антиоксидантам относятся низкомолекулярные белки плазмы: аскорбиновая кислота (витамин С), α-токоферол (витамин Е), β-

каротин (витамин А), а также мочевая кислота, билирубин и др. [Arai, 2001].

Ферментный механизм защиты от АФК опосредован действием таких основных антиоксидантных ферментов, как супероксиддисмутаза и каталаза,

инициирующая разложение H2O2 до O2 и H2O. Молекула глутатиона (GSH)

играет ключевую роль в поддержании баланса между прооксидантами и антиокидантами. Антиоксидантный фермент глутатионпероксидаза катализирует реакцию восстановления перекиси водорода до воды с

помощью молекулы глутатиона:

H2O2 + 2 GSH 2GSSG+ H2O

Затем окисленный глутатион (GSSG) восстанавливается с помощью

NADPH и глутатионредуктазы в ходе реакции:

GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+

28

Помимо универсальных механизмов негативной регуляции нейтрофилов, описаны и другие, еще малоизученные пути. Один из них осуществляется за счет последовательностей ITIM (immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif), которые, деактивируют тирозиновые рецепторы,

участвующие в сигнальных путях активации нейтрофилов [Daëron et al., 2008].

Изучены механизмы, по которым АФК активируют NFR2-

транскрипционный фактор, стимулирующий работу антиоксидантных систем, или увеличивают трансляцию NFR2-транскрипционного фактора через PI3К [Kensler et al., 2007; Purdom-Dickinson et al., 2007].

Показано, что mTOR сигнальный путь (от target of rapamycin) негативно регулирует активность формирования NET и координирует работу внутриклеточных сигнальных путей, ингибирующих активацию нейтрофилов

[Itakura and McCarty 2013].

Еще один эффективный механизм регуляции активности нейтрофилов осуществляется через рецептор к хемерину ChemR23, преимущественно синтезируемому в печени. Этот рецептор экспрессируется на макрофагах,

дендритных клетках и активированных эндотелиальных клетках и индуцирует активацию макрофагов, усиливая их фагоцитарную активность и поглощение апоптозных нейтрофилов [Cash et al., 2010]. Данный механизм уменьшает риск развития некроза нейтрофилов и высвобождения их содержимого наружу.

В экссудате в очаге воспаления охарактеризованы противовоспалительные липидные медиаторы: резолвины и протектины.

Действие резолвина E1 основано на активации ChemR23, а также блокировании рецептора лейкотриена 4, что ингибирует активацию нейтрофилов [Arita et al., 2007], тогда как протектин D1 активирует полимеризацию актина и β2-интегринов [Schwab et al., 2007].

29

Временная негативная регуляция может осуществляться в момент адгезии нейтрофилов опосредованно через сигналы от интегриновых рецепторов. Активация интегриновых рецепторов может регулировать активность NADPH-оксидазы через белок Rac2 за счет ингибирования процесса полной сборки NADPH-оксидазного комплекса [Zhao et al., 2003].

Недавно был описан путь аутокринной негативной регуляции активности нейтрофилов с участием молекулы пентраксина,

высвобождаемого из специфических гранул нейтрофилов. Было показано,

что пентраксин связывается с Р-селектином на эндотелиальных клетках и блокирует последний, тем самым препятствуя захвату нейтрофилов эндотелильными клеткамим и дальнейшей их миграции в ткани [Deban et al., 2010].

Таким образом, в организме реализуется несколько уровней защиты от гиперфункции нейтрофилов, основанных на разнообразных механизмах,

препятствующих активации нейтрофилов либо влияющих на метаболизм АФК.

1.4. Белки теплового шока

Белки теплового шока (HSP, от heat shock proteins) составляют одну из молекулярных систем, направленных на защиту клетки от различных цитотоксических факторов.

Свое название эти белки получили из-за того, что тепловое воздействие индуцировало в клетках их массированный синтез. Позднее было установлено, что экспрессия белков теплового шока является реакцией на целый спектр неблагоприятных факторов, таких как гипоксия, соли тяжелых металлов, окислительный стресс, излучение, алкоголь, магнитное поле,

воспаление, инфекции и др. Белки HSP обнаружены во всех исследованных организмах и клетках, что позволяет относить их к наиболее консервативной и универсальной системе стресс-индуцируемого клеточного ответа. В то же

30