диссертации / 85
.pdfГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ
ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
Тихонов Дмитрий Александрович
ДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА НА КЛЕТКИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ЭНДОМЕТРИЯ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Карева Елена Николаевна
Москва 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений Введение Глава 1. Обзор литературы
1.1.Лиганды рецепторов прогестерона
1.2.Лиганды рецепторов прогестерона и иммунная система
1.3.Гиперпластические процессы эндометрия
1.4.Рецепторы половых стероидов в ткани эндометрия
1.5.Лечение гиперпластических процессов эндометрия
1.6.Заключение
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1.Материалы для исследования
2.1.1.Используемые реактивы
2.1.2.Используемое оборудование
2.1.3.Объекты исследования
2.1.4.Дизайн исследования
2.2.Методы исследования
2.2.1.Выделение мононуклеарной фракции клеток из периферической крови
2.2.2.Определение специфического связывания 3Н-
прогестерона с прогестерон-связывающими участками МНФК периферической крови
2.2.3. Определение специфического связывания
6
8
13
13
25
31
38
42
44
46
46
46
47
48
51
53
53
54
55
3
синтетических стероидов с рецепторами прогестерона
2.2.4.Жидкостная сцинтилляционная радиометрия
2.2.5.Инкубация клеток с прегна-D’-пентаранами и прогестероном
56
56
2.2.6. Оценка метаболической |
активности клеток |
(МТТ-тест) |
57 |
2.2.7.Определение уровня ФНО-α с помощью иммуноферментного анализа
2.2.8.Выделение мРНК из клинического материала
2.2.9.Реакция обратной транскрипции для получения
кДНК
2.2.10.Полимеразная цепная реакция в реальном времени для определения уровня экспрессии генов
2.2.11.Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Определение специфического связывания прегна-D’-
пентаранов с прогестерон-связывающими участками клеток мононуклеарной фракции периферической крови
3.2.Анализ влияния прегна-D’-пентаранов на уровень продукции ФНО-α мононуклеарной фракцией периферической крови
3.3.Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность неизмененных и опухолевых гормон-чувствительных клеток
3.3.1.Влияние прегна-D’-пентаранов на
58
58
58
58
61
63
63
66
68
69
4
жизнеспособность мононуклеарной фракции клеток периферической крови
3.3.2. Влияние прегна-D’-пентаранов на |
|
жизнеспособность опухолевых клеток Hela и MOLT-4 |
72 |
3.4. Влияние прегна-D’-пентаранов на экспрессию генов |
|
рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках |
|
мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с |
76 |
гиперпластическими процессами эндометрия |
|
3.4.1. Экспрессия генов ядерных и мембранных |
|
рецепторов стероидных гормонов в МНФК |
|
периферической крови пациенток постменопаузального |
77 |
возраста без гинекологической патологии |
|
3.4.2. Экспрессия генов рецепторов эстрадиола и |
|
прогестерона МНФК периферической крови пациенток |
|
постменопаузального возраста с железисто-фиброзными |
85 |
полипами эндометрия |
|
3.4.3.Экспрессия генов ядерных и мембранных |
|
рецепторов эстрадиола и прогестерона МНФК |
|
периферической крови пациенток постменопаузального |
91 |
|
|
возраста с железистой и железисто-кистозной |
|
гиперплазией эндометрия |
|
3.4.4. Экспрессия генов ядерных и мембранных |
|
рецепторов стероидных гормонов в МНФК у пациенток |
|
постменопаузального возраста с аденокарциномой |
95 |
эндометрия |
|
3.4.5. Влияние прегна-D’-пентаранов на экспрессию |
101 |
|
5
генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК
3.5. Структурно-функциональный анализ соединений гомологического ряда прегна-D’-пентаранов и выбор наиболее активных соединений
Выводы Список литературы
104
106
107
6
Список сокращений
Ct – пороговый цикл амплификации
DBD – ДНК-связывающий домен
ERα, ERβ – ядерные рецепторы эстрадиола
GAPDH - глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа
Hela – культура эпителиоидного рака шейки матки человека
IFN - интерферон
IL - интерлейкин
LBD – лиганд-связывающий домен
mER – мембранный рецептор эстрадиола
MOLT-4 – культура Т-клеточного лейкоза человека
MTT-тест – реакция на основе превращения 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5- дифенилтетразолиума бромида в формазан
NK-клетки – клетки - естественные киллеры
PAQR7, mPR – мембранный рецептор прогестерона
PGRmC1 – мембранный рецептор прогестерона компонент 1
PIBF – прогестерон-индуцированный блокирующий фактор
PR-A, PR-B – ядерные рецепторы прогестерона
Th – лимфоциты группы T-хелперов
TLR - Toll-подобные рецепторы
Treg – Т-регуляторные клетки
аГРГ - агонисты гонадотропин-рилизинг гормон ГПЭ – гиперпластические процессы эндометрия ДК – дендритные клетки
7
ЖФПЭ – железисто-фиброзный полип эндометрия кДНК – комплементарная ДНК, построенная на основе мРНК
МНФК (МНФ) – мононуклеарная фракция клеток периферической крови мРНК – матричная РНК
ПЦР–РТ (PCR-RT) – полимеразная цепная реакция в реальном времени ФНО (TNF) – фактор некроза опухолей
8
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Лечение гиперпластических процессов эндометрия до настоящего времени остается одной из наиболее актуальных задач современной медицинской науки.
Это связано с высокой распространенностью данной патологии (в среднем до 9%
пациенток) [52, 85], неуклонным ростом заболеваемости, особенно в постменопаузальном периоде [14, 30, 52], частым бессимптомным течением,
малигнизацией и низкой эффективностью существующих методов консервативной терапии [17]. Недостаточная эффективность медикаментозного лечения гиперпластических процессов эндометрия может быть следствием отсутствия полной картины этиопатогенеза этого заболевания и ограниченным спектром, разрешенных к применению, лекарственных средств.
Патогенетически обоснованной тактикой медикаментозного лечения гиперпластических процессов эндометрия является снижение эстрогенного влияния на ткань. С этой целью используют гестагены, аналоги гонадолиберинов
(аГРГ) и комбинированные пероральные контрацептивы, одним из механизмов действия которых, является снижение концентрации гонадотропинов в крови и, в
конечном итоге, продукции яичниками эстрогенов. Однако, наличие эстрогенного компонента в комбинированных пероральных контрацептивах и тяжелые побочные эффекты аГРГ ограничивают их применение в клинической практике.
Поэтому, гестагены, с их оптимальным профилем безопасности, являются одной из наиболее востребованных групп препаратов для этой цели [32].
Поиск и изучение новых лекарственных средств, в частности, лигандов рецепторов прогестерона (чистых агонистов и селективных модуляторов рецепторов прогестерона) остается одним из важнейших фундаментальных и прикладных направлений в фармакологии [33]. К настоящему времени синтезированы новые синтетические производные прогестерона – прегна-D'-
пентараны – соединения с дополнительным карбоциклом в 16,17-положениях стероидного скелета, перспективные для изучения структурно-функциональных
9
свойств стероидных лигандов рецепторов прогестерона и поиска новых активных молекул для применения в клинической практике.
Современный системный подход в изучении этиопатогенеза, на основании которого формируется тактика медикаментозного лечения, диктует необходимость анализа взаимодействия эндокринной и иммунной систем,
влияния стероидных гормонов на функционирование иммунокомпетентных клеток в норме и при патологии [48, 108]. Тесная взаимная регуляция этих двух контролирующих систем организма давно известна. Так, развитию гормон-
зависимых опухолей тканей репродуктивного тракта женщины сопутствуют нарушения иммунной системы [14, 26, 48], с другой стороны – саногенез любого патологического процесса обеспечивается совокупностью усилий локального и системного звеньев иммунитета [6]. Поэтому для повышения эффективности гормональной терапии при гиперпластических процессах эндометрия необходимо изучить функциональное состояние иммунных клеток, которые можно рассматривать в качестве терапевтической мишени действия препаратов стероидных гормонов.
Цель работы: изучение фармакодинамических свойств новых синтетических лигандов рецепторов прогестерона в клетках-мишенях стероидных гормонов.
Задачи:
1.Определить уровень специфического связывания прегна-D'-пентаранов с прогестерон-связывающими участками мононуклеарной фракции периферической крови.
2.Изучить влияние прегна-D'-пентаранов на продукцию ФНО-альфа клетками мононуклеарной фракции крови.
3.Оценить действие прегна-D'-пентаранов на жизнеспособность неизмененных (МНФК) и опухолевых клеток (Hela, MOLT-4).
4.Исследовать влияние прегна-D'-пентаранов на экспрессию генов рецепторов половых стероидных гормонов в мононуклеарной фракции клеток
периферической крови у пациенток постменопаузального возраста без
10
гинекологической патологии, а также у больных с гиперпластическими процессами эндометрия.
5. Выявить соединения в ряду прегна-D’-пентаранов, обладающие наиболее высокой специфической связывающей активностью в отношении прогестерон-
связывающих участков мононуклеаров периферической крови, подавлением жизнеспособности опухолевых клеток при отсутствии токсического действия на неизмененные клетки, перспективные для использования в клинической практике.
Научная новизна
Впервые было изучено влияние прегна-D’-пентаранов на мононуклеарную фракцию клеток периферической крови у пациенток с гинекологической патологией, определена экспрессия генов подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола в мононуклеарах периферической крови у женщин постменопаузального возраста без гинекологической патологии и выявлены изменения рецепторного профиля МНФК при развитии гиперпластических процессов эндометрия.
Практическая значимость
На основании полученных данных было показано, что для доклинических испытаний наиболее перспективными соединениями класса прегна-D'-
пентаранов являются 6(E)-гидрокси-имино-16α,17α-циклогексано-прегн-4-ен- 3,20-дион) и 16α,17α-циклогексано-4-оксапрегн-5-ен-3,20-дион, которые обладают высокой специфической связывающей активностью с прогестерон-
связывающими участками клеток мононуклеарной фракции периферической крови, снижают выработку мононуклеарами крови ФНО-альфа, угнетают жизнеспособность опухолевых клеток (HeLa и MOLT-4) и не оказывают токсического действия на неизмененные клетки периферической крови.
Выявлено, что при развитии гиперпластических процессах у женщин с постменопаузальным периодом до 10 лет в мононуклеарной фракции периферической крови увеличивается уровень экспрессии гена рецептора эстрадиола подтипа альфа по сравнению с пациентками без гинекологической патологии в 4 раза (р<0,001). Превышение уровня экспрессии данного гена