диссертации / 81

3

фактора……………………………………………………………………….. 63 2.2.12. Методика определения цитокинового профиля…………………... 64 2.2.13. Методы оценки диагностического значения биомаркеров при

ревматоидном артрите…………………………………………….. 66 2.2.14. Методы статистической обработки результатов исследования…. 67

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………… 69

3.1. Клиническое значение аутоантител при ревматоидном артрите….. 69

3.1.1. Ревматоидные факторы………………………………………………. 69

3.1.1.1.IgM ревматоидный фактор………………………………………… 69

3.1.1.2.IgА ревматоидный фактор…………………………………………. 78 3.1.2. Антитела к цитруллинированным белкам………………………….. 86

3.1.2.1.Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду…….. 86

3.1.2.2.Антитела к модифицированному цитруллинировнному виментину…………………………………………………………... 95

3.1.2.3.Антитела к кератину……………………………………………….. 103

3.1.3 Многопараметрический анализ аутоантител при ревматоидном артрите………………………………………………………………… 108

3.2. Клиническое значение белков острой фазы воспаления при

3.3.1.Лиганд рецептора активатора транскрипционного фактора κB…. 112

3.3.2.Олигомерный матриксный белок хряща……………………………. 113

3.3.3.Матриксная металопротеиназа-3……………………………………. 114

3.4. Мультиплексный анализ цитокинов при ревматоидном артрите…… 116

3.4.1.Оценка влияния IgM РФ на результаты измерения концентраций цитокинов……………………………………………………………... 116

3.4.2.Клиническое значение оценки цитокинового профиля при ревматоидном артрите………………………………………………… 116

3.5.Сравнение уровней биомаркеров ревматоидного артрита в крови и синовиальной жидкости………………………………………………... 129

3.6.Клинико-лабораторные особенности пациентов с ревматоидным

артритом в зависимости от позитивности по антителам к цитруллинированным белкам…………………………………………... 135

3.7. Многопараметрический анализ биомаркеров в диагностике и

4

оценке активности ревматоидного артрита…………………………... 140

3.7.1.Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике раннего ревматоидного артрита……………………….. 140

3.7.2.Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике развернутого ревматоидного артрита…………………. 144

3.7.3.Применение многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров для оценки активности ревматоидного артрита……... 148

3.8. Многопарметрический анализ биомаркеров в оценке эффективности применения генно-инженерных биологических

препаратов при ревматоидном артрите………………………………... 152

3.8.1.Прогнозирование эффективности применения химерных моноклональных антител к TNF-α (инфликсимаба)……………….. 152

3.8.2.Прогнозирование эффективности химерных моноклональных

антител к мембранному CD20-антигену В-клеток (ритуксимаба)... 161

3.8.3.Прогнозирование эффективности гуманизированных

моноклональных антител к рецепторам IL-6 (тоцилизумаба)….. 169

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…….. 177

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… 203

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………… 206

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………….. 207 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………... 210

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Ревматоидный артрит (РА) – аутоиммунное ревматическое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим эрозивным артритом

(синовитом) и системным поражением внутренних органов [1]. В основе патогенеза РА лежит генетически детерминированная и индуцированная факторами внешней среды (курение, инфекции и др.) персистирующая активация приобретенного и врожденного иммунного ответа против разнообразных патогенов, что ведет к потере иммунологической толерантности в отношении собственных антигенов организма [2, 3]. Важной особенностью иммунопатологического процесса при РА является дефект В-клеточной толерантности, сопровождающийся продукцией аутоантител, и антиген-

специфическая активация CD4+ T-лимфоцитов по Th-1 типу с преобладанием синтеза провоспалительных (интерлейкин – IL-12, интерферон γ – IFN-γ, фактор некроза опухоли α – TNF-α, IL-1β, -6, -7, -15 -17, -18) над противовоспалительными (IL-4, -5, -10, -13, трансформирующий фактор роста-β- TGF-β) цитокинами [4, 5]. При РА ранняя лабораторная диагностика и активная противовоспалительная и иммуносупрессивная терапия в дебюте болезни увеличивают вероятность достижения ремиссии и снижают риск развития необратимого повреждения внутренних органов и тканей. Однако диагностика данного заболевания является сложной задачей в связи с недостаточной специфичностью клинических признаков и низкой чувствительностью клинико-

лабораторных критериев [6].

Современная лабораторная диагностика РА включает определение широкого спектра биомаркеров (аутоантител, показателей острой фазы воспаления,

цитокинов, маркеров активации эндотелия, субпопуляций лимфоцитов, продуктов метаболизма костной и хрящевой ткани, генетических маркеров) в крови,

синовиальной жидкости и синовиальной ткани [7, 8]. Наряду с «классическими»,

6

униплексными методами иммунодиагностики (ИФА, непрямая реакция иммунофлюоресценции, нефелометрия, хемилюминисценция и др.) все шире применяется мультиплексный анализ биомаркеров, основанный на генетических,

эпигеномных, транскриптомных и протеомных технологиях с использованием ДНК- и белковых микрочипов, ПЦР, проточной цитометрии, при этом наиболее перспективными в ревматологии являются протеомные исследования [9].

Результаты определения лабораторных биомаркеров позволяют получить объективную информацию о характере иммунопатологических нарушений при РА и являются важным инструментом для ранней диагностики, оценки активности, тяжести течения, прогноза болезни и эффективности проводимой терапии [10]. Среди биомаркеров, ассоциирующихся с РА, наибольшее клиническое значение имеют аутоантитела (ревматоидный фактор – РФ класса

IgM, антитела к цитруллинированным белкам – АЦБ) и острофазовые показатели

(СОЭ, С-реактивный белок - СРБ), которые относятся к диагностическим критериям РА и могут использоваться при оценке прогноза этого заболевания

[11].

РФ – аутоантитела IgM, IgA и IgG классов, реагирующие с Fc-фрагментом IgG.

Наибольшее значение в клинической практике имеет IgM РФ, так как положительные результаты его определения в сыворотке крови являются диагностическим критерием РА [11]. IgМ РФ - диагностически чувствительный,

но недостаточно специфичный показатель, так как может обнаруживаться в сыворотках при других ревматических заболеваниях (РЗ), хронических инфекциях, болезнях легких, злокачественных новообразованиях, первичном биллиарном циррозе и в пожилом возрасте [12]. Определение IgM РФ в высоких титрах полезно для прогнозирования быстропрогрессирующего деструктивного поражения суставов и системных проявлений при РА [2]. IgA РФ часто обнаруживается при РА с полиартикулярным вариантом начала заболевания и внесуставными (системными) проявлениями. Обнаружение IgA PФ может обладать определенной прогностической ценностью в отношении развития тяжелой эрозивной деструкции суставов [13, 14].

7

Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) –

высокоспецифичный и чувствительный серологический маркер РА,

превосходящий по своему диагностическому значению IgM РФ. Определение АЦЦП используется для диагностики раннего РА, подтверждения диагноза серонегативного РА, прогнозирования тяжелого эрозивного поражения суставов и дифференциальной диагностики с другими РЗ [15].

Литературные источники указывают на достаточно высокую диагностическую эффективность определения антител к модифицированному цитруллинированному виментину (АМЦВ) для диагностики РА, при этом описывается более низкая диагностическая специфичность (ДС) данных антител по сравнению с АЦЦП [16, 17]. Показано, что АМЦВ может являться лучшим,

чем АЦЦП предиктором крайне неблагоприятного прогноза суставной деструкции [18]. При этом, данные о взаимосвязи АМЦВ с активностью заболевания носят противоречивый характер.

Антикератиновые антитела (АКА), являются еще одним представителем АЦБ и обладают высокой ДС при РА [19]. Отмечена связь позитивности по АКА с тяжестью заболевания и выраженностью суставной деструкции [20]. Несмотря на это, они не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей, связанных со стандартизацией субстрата и субъективностью оценки результатов иммунофлюоресцентного теста.

Другим важным аспектом лабораторной диагностики РА является исследование уровня маркеров воспаления в крови, среди которых наиболее часто используются скорость осаждения эритроцитов СОЭ и СРБ [21]. СРБ – наиболее чувствительный и стандартизованный маркер воспаления, инфекции и тканевого повреждения. Уровень СРБ лучше всего коррелирует с индексом активности заболевания – Disease Activity Score 28 (DAS28) по сравнению с другими острофазовыми белками [20]. Увеличение базальной концентрации СРБ ассоциируется с повышенным риском развития рентгенологических изменений,

свидетельствующих о тяжелом деструктивном поражении суставов [21].

8

При РА в синовиальных ткани и жидкости, а также в сыворотке крови происходит повышение содержания такого провоспалительного маркера, как кальпротектин (КП), представляющего собой гетерокомплекс белков

S100A8/S100A9. Описана корреляция сывороточной концентрация данного показателя с маркерами острой фазы воспаления (СОЭ, СРБ) активностью заболевания и прогрессированием суставной деструкции [22].

У пациентов с РА повышенные сывороточные концентрации таких показателей костного и хрящевого метаболизма, как: лиганд рецептора активатора транскрипционного фактора κB (RANKL) и олигомерный матриксный белкок хряща (COMP), матриксная металлопротеиназа-3 (ММП-3) могут служить предикторами развития тяжелого деструктивного поражения суставов [23-25].

Провоспалительные цитокины способствуют развитию локальных провоспалительных эффектов, вызывая активацию эндотелия и накопление лейкоцитов в полости сустава, секрецию протеаз и матриксных металлопротеиназ; индуцируют костную деструкцию и образование паннуса;

участвуют в развитии аутоиммунных нарушений и системных проявлений при РА. [26-32]. Цитокины, обладающие выраженными противовоспалительными свойствами, способны замедлять суставную деструкцию. Существуют данные об участии не только Th1 но и Th2 цитокинов в развитии раннего РА. Эти факты свидетельствуют о необходимости более тщательного изучения баланса между

Th1 и Th2 типами иммунного ответа на разных стадиях заболевания [33-35].

В основе стратегии поиска биомаркеров лежит выявление из общего количества исследуемых показателей, так называемых “кандидатных” обладающих наилучшей диагностической чувствительностью (ДЧ) и

специфичностью (ДС). К настоящему времени не удалось обнаружить

“идеальный” биомаркер РА обладающий высокими ДЧ и ДС - выявление которого позволяет поставить верный диагноз в отсутствие клинических признаков заболевания. В связи с этим, для повышения клинической информативности теста, начинают создаваться диагностические индексы полученные путем многопараметрического анализа “in vitrо” (In Vitro Diagnostic

9

Multivariate Index Assay, IVDMIA, МДИ) [36-39]. Одной из наиболее актуальных задач иммунодиагностики является разработка и клиническая валидация МДИ для диагностики РА. Инструментом для этого может служить мультиплексный анализ – принципиально новый уровень лабораторных исследований в ревматологии, позволяющий проводить одновременное тестирование множества аналитов в одном образце биоматериала идентифицируя, таким образом,

индивидуальные профили белковых биомаркеров [40].

Разработка и быстрое внедрение в клиническую практику генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП), включая моноклональные антитела против определенных детерминант иммунокомпетентных клеток, или провоспалительных цитокинов, обуславливает необходимость совершенствования иммунологических методов мониторинга и поиска предикторов эффективного ответа на проводимую терапию[5]. Данные, касающиеся использования иммунологических маркеров для прогнозирования эффективности ГИБП при лечении РА, являются достаточно противоречивыми. В последние годы в качестве предиктивных биомаркеров ответа на терапию ГИБП наряду с рутинными клинико-лабораторными показателями все шире применяется мультиплексный анализ биомаркеров, основанный на протеомных технологиях,

открывающий новые возможности в поиске иммунологических предикторов ответа на терапию ГИБП при РА [41].

Таким образом, применение многопараметрических иммунологических методов исследования открывает новые перспективы для идентификации индивидуальных профилей лабораторных биомаркеров и создания МДИ, что в свою очередь позволит радикально улучшить раннюю диагностику РА (возможно,

на доклинической стадии), оценку активности, тяжести заболевания,

прогнозирование исходов патологического процесса и ответа на проводимое лечение.

10

Цель исследования

Оценить значение многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров в изучении особенностей иммунологических нарушений при РА,

диагностике, оценке активности заболевания и прогнозировании эффективности терапии ГИБП.

Задачи исследования

1.Оценить клинико-диагностическое значение определения аутоантител

(IgM/IgA РФ, АЦЦП, АМЦВ, АКА) в сыворотке крови при РА.

2.Изучить связь уровней белков острой фазы воспаления (СРБ, кальпротектин) в

сыворотке крови с активностью заболевания и деструктивным поражением суставов при РА.

3.Проанализировать уровни маркеров метаболизма костной и хрящевой ткани

(sRANKL, COMP, MMП-3,) в сыворотке крови при РА и их взаимосвязь с лабораторными показателями аутоиммунитета, воспаления и эрозивным поражением суставов.

4. Исследовать концентрацию цитокинов (IL-1β,-1ra,-2,-4,-5,-6,-7,-9,-10,-12,-15,- 17 TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF), хемокинов (IL-8,-10, MCP-1, MIP-1α,-1β, IP10, RANTES) и факторов роста (FGF-2, PDGF-BB, VEGF) в сыворотке крови при РА в сопоставлении с клинико-лабораторными проявлениями заболевания,

оценить динамику показателей цитокинового профиля на фоне терапии ГИБП.

5.Сопоставить уровни биомаркеров в сыворотке крови и синовиальной жидкости

убольных РА.

6.Сравнить профили протеомных маркеров у АЦБ-позитивных и АЦБ-

негативных пациентов с РА.

7.Разработать многорапаметрические лабораторные индексы для диагностики,

оценки активности и прогнозирования эффективности терапии ГИБП при РА.