диссертации / 33
.pdfтоксикодействия. Помимо этого инактивировали активность печеночных глутатион-S-трансферазы, глутатион-пероксидазы и глутатион-редуктазы и индуцировалиусиливали окислительное повреждение гепатоцитов крыс
(Ostiguy C., 2006). Показаны уменьшение активности щелочной фосфатазы и уровня триацилглицеридов, увеличение селезенки, снижение масс тимуса и сердца, активности АСТ, определялась нефропатия (Ostiguy C., 2006).
Негативный ответ получен приизучение уровня мутагенов трех производных
C60 на Salmonella thyphimurium и Escherichia (Ostiguy C., 2006). Индукция активных форм кислорода и окисление биологических молекул это ведущая причинаагрессии углеродных наноструктур. Изыскания цитотоксичности на
2 полосах человеческих эпителиоцитов диоксида кремния в виде нанопроволоки и наночастиц in vitro выявили, что концентрация 190 мкг/мл пороговая, ниже нее нетэффектов токсичности. При повышении концентрации разрушаютсямембраны (маркером является цитозольная ЛДГ),
развивается некроз клеток. Перорально вводимые наночастицы на основе полистирола (30, 100 и 300 нм) попадаютв селезенку и печень. 50 %
животных гибло при инъецировании наночастиц полиизобутил-
цианоакрилата размером 200 нм в дозе 40 мл/кг. Только при высоких дозах
(от 1,4 до 3600 пМ/мышь) показано воспаление и легких тромбоз, что подтвердили изыскания квантовых точек на основе CdSe/ZnS в дозах. При этом в почках кадмий не определялся. Анализ литературных данных токсических свойств наночастиц и наноструктурированных материалов показывает их недостаточность. Определено, что токсичность связана с путем получения, структурой нанокластеров и наночастиц, размерами, а
также от опытной модели, на которой проводятся изыскания. Разнятся органы воздействия и пути развития токсического эффекта. Ряд наноструктурированных материаловсоздает активные формы О2 (Long T.C., Reevesa J.F., 2005). Изменяютсяпути прохождения через тканевые барьеры,
внутриклеточно и взаимодействовать с компонентами цитозоля (Глушкова
А.В., 2005, Kaura I.P., 2010)
71
На мышах продемонстрированы отличия в токсичности микрочастиц и наночастиц цинка. При этом микрочастицы цинка оказались более токсичны,
чем наночастицы. Определено повреждение функции почек, наночастицы цинкаиндуцировалии непорядок системы свертывания крови и анемию
(Wang B., 2006).
Известно, что некоторые наночастицы вызывают нарушение функции лизосом. Так, например, было показано, что кварцевые наночастицы могут вызывать повышение проницаемости мембран лизосом и высвобождение лизосомальных ферментов с последующим запуском апоптоза альвеолярных макрофагов (Thibodeau et al., 2004). Активация аутофагии in vitro была отмечена под действием наноразмерных частиц оксида неодима (Chen et al., 2005), квантовых точек (Seleverstov et al., 2006) и фуллеренов (Yamawaki, Iwai, 2006).
К настоящему времени было опубликовано всего несколько исследований, посвященных изучению потенциальных канцерогенных эффектов наночастиц и наноматериалов. Согласно данным Nelson et al. (1993) и Mori et. al. (2006), фуллерены не стимулируют формирования опухолей при длительном нанесении на кожу животных и не обладают мутагенным действием на клеточных культурах. С другой стороны, было показано, что фуллерены могут оказывать мутагенный эффект in vitro при облучении видимым светом и наличии микросом, выделенных из гепатоцитов (Sera et al., 1996). Мутагенность фуллеренов при их облучении,
по-видимому, связана с образованием липоперекисей за счет высвобождения синглетного кислорода в процессе перехода молекулы фуллерена из возбужденного в стационарное состояние. Суммируя результаты исследований, посвященных изучению мутагенных эффектов наночастиц оксида титана, можно сделать следующий вывод. Некоторые исследования,
выполненные in vitro на изолированных клетках и клеточных культурах,
показали, что воздействие ультрафиолета может приводить к
цитотоксическим и генотоксическим эффектам. С другой стороны,
72
исследования, проведенные in vivo, не подтверждают наличия какого-либо онкогенного эффекта данных наночастиц.
При изучении отдельных видов наночастиц было показано, что одними из первых были объекты, которые давно известны, являются металлические наночастицы и формируемые ими нанокластеры. Изучены наночастицы серебра и золота (Дыкман Л.А, 2008). Тип модификации золотых наночастиц действует на функционирование макрофагов, на токсический эффект in vitro.
Эксперименты на эмбрионах потоксичности наночастиц золота выявили, что эмбриотоксические свойства явны у наночастиц размером 0,8 нм, чем 1,5 нм.
В широкомасштабныех исследованиях Коваленко и Фолманиса
(Коваленко Л.В., 2008) проведены воздействия наночастиц железа на крупнорогатый скот, мышей, рыб, птиц, крыс, некоторые растения. При пероральной острой экспозиции взвеси наночастиц железа мышам не выявлено токсических реакций в дозе 50, 100 и 500 мкг/кг. На культуре клеток человеческихфибробластов выявленопонижение токсичности суспензии оксида железа γ-Fe2O3 вместе с гуминовыми кислотами (по материалам сайта: «www.nanometer.ru»). Показана эмбриотоксичность и тератогенные эффекты (Withdrawal assessment, 2010). При вдыханиикрысами линии Sprague Dawley наночастиц оксида железа размерами 22 и 280 нм в дозах 0,8 и 20 мг/кг индуцировало активные формыО2 в клетках,
гиперплазию, гиперемию и фиброз легочных тканей. В крови показано повреждение системы свертывания (Zhu M.-T.) Изыскания свойств наночастиц цинка и его оксида на редисе (Raphanus sativus), кукурузе (Zea mays L.), огурце (Cucumis sativus), рапсе (Brassica napus napus), определили,
что вдоза 2000 мг/л снижает удлинение корней и ухудшает прорастание кукурузных семян. Усиливающая величина (IC50) - 50% для редьки, которая составила 50 мг/л, рапса – 20 мг/л (Lin D., 2010). Часто применяетсяв составе наноструктурированных материалов и в чистом виде оксид титана. При ингаляции крысам токсикологические исследования тонких (250 нм) и
ультратонких (20 нм) TiO2 показали, что частицы размером 20 нм
73
накапливаются в лимфоидных тканях (Ostiguy C., 2010), повреждают ДНК лимфоцитов и нейроцитов. В результате возникаютреактивные формы кислорода, накопления малонового диальдегида и окислительного стресса
(Глушкова А.В., Kang S.J., Long T.C., Lu N.).
При совокупном анализе данных литературы становится очевидным что не везде и не всегда наноструктурированные материалы действуют токсично или оказывают иное повреждающее влияние. Ряд исследователей показали цитотоксический эффект, в частности магнитных частиц на базе оксида железа (Withdrawal assessment report, Zhu M.-T., Feng W.Y), иные доказывают их безвредность (По данным сайта: «www.nanometer.ru»,Пул Ч., 2010), что свидетельствует о необходимости дальнейших изысканий в этой сфере.
74
2.Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1.Материалы исследования
Эксперимент был выполнен нами на 832 крысах-самцах линии
"Вистар" массой 200-250 граммов из питомника РАМН «Столбовая» Московской области, которые в комфортные температурные условиях пребывали в виварии(температура окружающего воздуха около 21°С).
Световой день составлял двенадцать часов. Для питания животных использовались полноценные корма для грызунов с дополнительным прикормом в виде фруктов и овощей. Вода употреблялась животными самостоятельно из поилок. Пища и жидкость принимались животными ad libitum. Текущая уборка клеток осуществлялась ежедневно. Генеральная уборка с дезинфекцией клеток выполнялась еженедельно. Все манипуляции содержания животных, проведения процедур и тестирования полученных данных проводились в соответствии со стандартами ISO 10993-1-2003 и
ГОСТ Р ИСО 10993.2-2006.
Для проведения эксперимента животные были поделены на 6 групп:
1.Особи, которым была выполнена трефанация черепа без применения имплантатов и биокомпозитов - 60 животных.
2.Животные, которым был внедренбиокомпозит после трефанации черепа:
2.1.Состоящий из желатинагидроксиапатитадекстрана – 50 особей.
2.2.Состоящий из коллагена - гидроксиапатита (ГАП)– декстрана - 50.
3.Особи, которым введен имплантат после трефанацииизизнаноструктурированоого титана:
3.1.Наноструктурированный титан ВТ1-0:
3.1.1.Наноструктурированный титан ВТ1-0 без покрытия - 60 особей.
3.1.2.Наноструктурированный титан ВТ1-0 покрытыйкальций-
фосфатнымслоем - 60 особей.
3.2.Наноструктурированоого титана Grey:
75
3.2.1.Подвергнутый МДО обработке –60 особей.
3.2.2.Подвергнутый ПСО обработке – 60 особей.
4. Особи, которым внедрен композитный материал из наноструктурированоого титана Grey с биопокрытиями;
4.1.С одним слоем покрытия (желатин, декстран):
4.1.1.ПодвергнутыйМДО обработке – 60 особей.
4.1.2.Подвергнутый ПСО обработке – 60 особей.
4.2.С двумя слоями покрытия (первый - желатин, декстран коллаген,
декстрана; второй - гидроксиапатит коллаген, декстрана CPH926 «Имтек»):
4.2.1.Подвергнутый МДО обработке – 60 особей.
4.2.2.Подвергнутый ПСО обработке – 60 особей.
5. Животные, которым имплантирован композит из наноструктурированоого титана Grey покрытого слоями биокомпозов: с двумя слоями (первый -
желатин, декстран коллаген, декстрана; второй - гидроксиапатит коллаген,
декстрана) и с внедрением КМБ (ВМР-2):
5.1.Подвергнутый МДО обработке – 60 особей.
5.2.Подвергнутый ПСО обработке – 60 особей.
6. Животные, которым были введены наночастицы железа:
6.1.На кожные покровы– 30 особей.
6.2.Интраназально– 30 особей.
6.3.Контрольная группа – 20 особей.
2.2. Методы исследования Для изучения морфогенеза и патогенеза в системе макроорганизм –
костная ткань - наноструктурированный объект нами были разработаны экспериментальные модели реконструкции черепа следующего характера:
Выполнение трефанации черепа. Вводный наркоз осуществлялся при помощи диэтилового эфира. Использовалась стеклянная емкость с плотно-
притертой крышкой для исключения испарения эфира в окружающую среду.
В емкости имелось ванночка в которую помещалась вата, после чего на вату
76
наносился диэтиловый медицинский эфир в объеме 1 мл. Животное помещалось в указанную емкость. Глубина наркоза соответствующая уровню
IIIа-б достигалась ингаляцией паров эфира.
Животное извлекалось из склянки и фиксировалось на препараторском столике за четыре конечности. После чего проводилась предоперационная подготовка операционного поля, которая заключалась в выбривании волосяного покрова в лобной, теменных, затылочной областях. Далее выполнялась частичная санитарная обработка операционной области мыльным раствором, с последующим окончательным промыванием дистиллированной водой. Голова животного фиксировалась с помощью
«шлема», исключающего изменения положения во время оперативного пособия. Поддерживающий наркоз также осуществлялся диэтиловым эфиром масочным способом. С соблюдением правил асептики и антисептики выполнялась трехкратная обработка операционного поля раствором йодоната, осуществлялось линейное рассечение кожи и апоневроза,
начинавшийся в левой теменной и заканчивающийся в правой теменной областях. Края раны разведены ранорасширителем к носу и каудально,
фиксированы в таком положении. Линейный разрез надкостницы с последующим скелетированием теменных костей распатором на площади необходимой для размещения имплантата. Выполнялся окончательный гемостаз для исключения кровотечения из мягких тканей. Трефинация черепа производилась набором инструментов для осуществления нейрохирургического пособия новорожденным. Область осуществления трефинации – центр костей темени черепа. Первичное отверстие производилось копьевидной фрезой, с дальнейшим увеличением диаметра до необходимого корончатой фрезой.
Гемостаз производился тампонадой стерильными, смоченными 3%
раствором перекиси водорода, салфетками. В дефект кости на «сухую» рану помещался имплантат, жесткая фиксация которого не проводилась. Рана
ушивалась наглухо узловыми шелковыми швами через все уровни мягких
77
тканей головы и надкостницу. Послеоперационный шов обрабатывался 5%
этиловым раствором бриллиантового зеленого без наложения защитной повязки. Затем животное снималось с препараторского столика и помещалось в отдельную клетку на 2 часа для восстановления после перенесенного вмешательства. На протяжении последующих 3-х суток послеоперационный шов обрабатывался 1 раз в сутки 5% этиловым раствором бриллиантового зеленого. Профилактика гнойных осложнений осуществлялась соблюдением правил асептики и антисептики.
В работе использованы наши патенты на полезную модель " Фиксатор головы животного" (Павлова Т.В. и соавт., №103725.) и "Устройство для ингаляционного наркоза мелких лабораторных животных" (Павлова Т.В. и соавт., №103726).
1 группу составили животные без применения биокомпозитов и имплантатов. Во 2 группу отнесены особи с использованием биокомпозитов из желатина, ГАП, декстрана и коллагена – ГАП – декстрана, помещаемых в рану CPH926 «Имтек». В следующей группе выполнено имплантирование образцов из наноструктурированного титана ВТ1-0 Размеры имплантатов составляли: диаметр - 1 мм, длина - 3 мм. Имплантирование образцов из наноструктурированного титана Grey, подвергнутого с МДО и ПСО (3.2).
При этом, в асептическое отверстие черепа помещался имплантат диаметром 5,1±0,11 мм, толщиной 0,7±0,11 мм без жесткой фиксации. У наноструктурированного титана размер зерна был 200 нм, пластичность 11 %,а прочность 1240 МПа. Применялись дисковые имплантанты, изготовленные в Уфимском государственном авиационном техническом университете, толщиной 0,7±0,11 мм, диаметром 5,1±0,11 мм. Использовалась авторская технология (Валиев Р.З. и соавт., 2007; Валиев Р.З. и соавт., 2008). Диски сверху обрабатывались путем микродугового оксидирования (МДО).
Помимо этого, использовались имплантаты из наноструктурированного
титана ВТ1-0 с кальций-фосфатным покрытием (3.1.2). А также образцы из
78
титана Greyобработанные методами МДО или ПСО (4 группа). При этом стерильные диски из наноструктурированного титана покрывали первым слоем композита, слагающийся из 10% медицинского желатина и 10%
высокомолекулярного декстрана, растворенных в 50 мл фосфатного буфера.
Затем их в стерильных условиях высушивали, обделывали 0,2% раствором глутарового альдегида и высушивали вновь. После этогопокрывали 2-м
слоем, включающий 10% гидроксиапатита и 0,25% коллагена.
Помимо этого, в 5 группе на второй слой наносились костные морфогенетические белки, а именно ВМР-2 (Рис.1).
Дифференцированный анализ репаративных свойств кости проводился на материале тканей черепа при введении нанокомпозитов.
Экспериментальных животных выводили посредством декапитации в условиях передозировки парами эфирного вечером в последовательности:
один день, одна, две, четыре, восемь, двенадцать, четырнадцать, шестнадцать недель.
Рис. 1. Операция с внедрением имплантата из наноструктурированного титана с ВМР – факторами.
Группу номер 6 составили животные, которым были введены
наночастицы железа для изучения контакта с организма с наночастицами.
79
Нами было показано наличие в суспензии наночастиц Fe, как при помощи трансмиссионной (Рис. 2), так и сканирующей (Рис. 3) электронной микроскопии. Помимо этого, его содержание выявлено с применением изучение микроэлементного состава с применением растровой электронной микроскопии. Этими же методами изучено нахождение наночастиц Fe в
органах и тканях.
Нанопорошок железа был помещен на углерод тонкой пленки и исследовали с помощью электронной трансмиссионной микроскопии с целью определения структуры и состава. При изучении нанопорошек в суспензии был осажден на кремневой пластинке. Капельки суспензии были удалены после его сушки. Компоненты железа были найдены с помощью сканирующей электронной микроскопии. Было показано, что наноструктурированный порошок железа состоял из чистого элемента
(округлой формы) и его оксида (удлиненные иглы) (Рис. 2,3). Картина дифракции Fe нанопорошка состоит из отражения от железа и оксида железа наночастиц в порошок, представленный в двух формах. Первый из них отделяется или немного агломерированных частиц. Размер этих частиц закрыт в области 5-100 нм. Вторая форма имела частицы, которые составляли менее пористым агломератов в виде пластинчатых пластин с характерным размером примерно несколько сотен нанометров в диаметре и шириной около 100-300 нм. Оксиды Fe частицы имели форму иглы и имеют типичный диаметр около 20 нм, а отношение длины к диаметру 1:05 - 1:10.
Качественный анализ элементного состава Fe нанопорошка проводили с использованием энергии дисперсионного рентгеновского спектрометра интегрирован со сканирующей электронной микроскопии (Рис. 4).
80