диссертации / 25

71

при 8000 об. /мин в течение 6 минут.

Для оценки морфофункциональных характеристик циркулирующих

эритроцитов производился расчет следующих эритроцитарных индексов (Люби-

на А. Я. и др., 1984).

1. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ, пг):

ССГЭ = Нb / Э,

где Нb - концентрация гемоглобина в крови (г/л), Э - концентрация эритроцитов в крови (Т/л).

2. Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКГЭ, %):

СКГЭ = 10Нb / Ht;

где Нt - показатель гематокрита (%).

3. Средний объем эритроцита (СОЭр, мкм3):

СОЭр = 10Ht / Э.

Для оценки активности эритропоэза производили подсчет количества ре-

тикулоцитов на 1000 эритроцитов в мазках крови, суправитально окрашенных бриллиантовым крезиловым синим.

Количество оксифильных проэритроцитов определяли в мазках крови,

окрашенных по Романовскому, на 100 лейкоцитов.

Исследование эритроидного ростка кроветворных органов проводили путем определения процентного содержания эритроидных клеток в мазках кост-

ного мозга и мазках-отпечатках селезенки и печени. Для этого у животного путем экзартикуляции извлекали бедренную кость и очищали ее от прикрепленных мышц. Ножницами перерезали диафиз бедра на уровне вертелов. В дистальном эпифизе срезали костную пластинку толщиной 1 мм. В шприц объемом 5 мл набирали воздух и соединяли его с иглой. Иглу вводили в костномозговой канал через губчатую кость дистального эпифиза. Далее надавливали на поршень, вы-

ступившую каплю костного мозга наносили на предметное стекло и делали мазок.

72

Полученные мазки высушивали, на воздухе и фиксировали в абсолютном метано-

ле 5 минут. После этого проводили реакцию на внутриклеточный гемоглобин с целью идентификации эритроидных клеток (Хейхоу Ф. Г., Кваглино Д., 1983).

Мазки докрашивали по Романовскому. Подсчет эритроидных клеток производили на 200 ядросодержащих клеток костного мозга и выражали в процентах. Анало-

гичным образом обрабатывали мазки-отпечатки селезенки и печени.

Б) ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ:

Использовали методику краткосрочного культивирования перитонеальных

(Mantovani B., 1987) и плацентарных макрофагов с аутологичными эритроцитами.

У животных производили забор крови из подъязычного венозного сплетения для приготовления суспензии эритроцитов в среде 199 (1:100). Для получения пери-

тонеальных макрофагов в брюшную полость вводили 10 мл среды 199, после массажа живота через разрез передней брюшной стенки получали суспензию кле-

ток. Ее наносили на покровные стекла и инкубировали в течение 15 минут при

370С в планшетах для культур клеток. Далее стекла промывали и в лунки планше-

та вносили по 2 мл суспензии эритроцитов.

Для оценки активности плацентарных макрофагов ткань 3 – 4 целых плацент разрезали на несколько более мелких частей и тщательно отмывали от крови, гомогенизировали, смешивали с физиологическим раствором, и пропуска-

ли через нейлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм. Затем клеткам давали осесть при 1500 об. /мин в течение 10 минут, отбрасывали надосадочную жидкость.

Осадок смешивали с 5 мл среды 199. Клеточную суспензию подвергали центрифу-

гированию в ступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина в течение 30

мин. В пробирку помещали 3 слоя: первый - фиколл-урографин плотностью 1,076;

второй - 2/3 раствора фиколл-урографина 1,076 + 1/3 дистиллированной воды;

третий – суспензия клеток плаценты. Аккуратно отбирали верхнее из двух колец,

образованных клетками на границе раздела фаз, после чего двукратно промывали средой 199. В отмытые клетки добавляли среду 199, после чего суспензию макро-

фагов инкубировали в 6-ти луночных планшетах на покровных стеклах 24 X 24 в

73

течение одного часа при 370С, далее стекла аккуратно промывали средой 199, удаляя не прикрепившиеся клетки, и заливали суспензией эритроцитов.

Суспензии эритроцитов содержали следующие вещества:

1) водорастворимый аналог токоферола trolox 6-гидрокси-2,5,7,8-диметилхроман- 2-карбоксильная кислота 97% (производитель Aldrich) в концентрации 1 и 25

мкмоль/л (Reed K. L. et al., 2006);

2) супероксиддисмутаза (производитель SIGMA) в концентрации 10 и 100 Еди-

ниц/мл (Hernanz R. et al. 2001);

3) липополисахарид E. coli (производитель SIGMA) в концентрации 10 и 100

нг/мл (ЛПС) (Filipov N. M. et al., 2005);

4)L-NAME (производитель SIGMA) в концентрации 0,1 и 1 ммоль/л (Wu R. et al., 2004);

5)водорастворимая форма β-эстрадиола (производитель SIGMA) в концентрации

10 и 100 нмоль/л (Okada M. et al., 1997);

6) водорастворимая форма прогестерона (производитель SIGMA) в концентрации

10 и 100 нмоль/л (Program of Plenary Sessions and Advance Abstracts of Short Communications).

Для получения контрольных значений к макрофагам добавляли суспензию эритроцитов без каких-либо веществ.

Планшеты инкубировали в течение 60 минут при 370 С. Стекла фиксирова-

ли в 1% растворе глутарового альдегида, затем окрашивали по Романовскому.

In vitro макрофаги крыс при взаимодействии с аутологичными эритроцита-

ми образуют розеткоподобные структуры. Производился дифференциальный под-

счет этих структур с выделением 4 типов: макрофаги без эритроцитов (МФ0),

макрофаги, несущие на своей поверхности 1 – 2 (1 тип; МФ1), 3 – 5 (2 тип; МФ2), 6 – 8 (3 тип; МФ3), более 9 эритроцитов (4 тип; МФ4). Для интегральной оценки рассчитывался индекс адгезионно-фагоцитарной активности (ИАФА):

ИАФА = (МФ1 + 2 * МФ2 + 3 * МФ3 + 4 * МФ4) / МФ0.

В) БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ.

74

Получение сыворотки периферической крови:

Для исследования содержания различных биологических продуктов в сыво-

ротке кровь из подъязычного сплетения у взрослых животных или при декапита-

ции у плодов и крысят отбирали в сухую центрифужную пробирку, на 10-15 мин оставляли до полного свертывания, осторожно обводили по стенке пробирки сгу-

сток крови длинной иглой, а затем центрифугировали 10 минут при 1500 об./мин.

Сыворотку крови, отделившуюся от сгустка, разливали в пробирки типа Эппен-

дорф и до проведения исследования хранили в холодильнике при температуре - 200С.

Оценка содержания биологических продуктов в плацентах:

Плаценты взвешивали, замораживали в пенициллиновых пузырьках при температуре -200С, перед исследованием к ним добавляли одинаковый объем ди-

стиллированной воды и гомогенизировали. Расчет проводили на грамм массы плаценты.

Концентрацию суммарных нитратов и нитритов определяли путем вос-

становления нитратов в нитриты в присутствии хлорида ванадия (Miranda K. M. et al., 2001). Результат выражался в мкмоль/л (для сыворотки) или мкмоль/г (для плаценты). Исследование выполнялось на базе лаборатории клинической биохи-

мии и генетики ФГБУ ИвНИИ М и Д Минздрава России. Выражаю благодарность н. с. Поповой И. Г.

Содержание кальция определяли с использованием набора для биохими-

ческих исследований фирмы Human. Результат выражался в ммоль/л. Исследова-

ние выполнялось на базе лаборатории клинической биохимии и генетики ФГБУ ИвНИИ М и Д Минздрава России. Выражаю благодарность с. н. с. Ситниковой О.

Г.

Концентрацию цитруллина определяли методом, основанным на реакции остатков цитруллина с диацетилмоноксимом в присутствии разбавленной серной кислоты и хлористого железа (Sugawara K. et al., 1998). Результат выражался в нмоль/л.

75

Определение количества свободных радикалов и антиоксидантной ак-

тивности проводилось методом индуцированной хемилюминесценции. Принцип метода заключается в том, что при введении в биологическую жидкость перекиси водорода и сульфата железа в системе происходит каталитическое разложение перекиси ионами металла с переменной валентностью. Образуются свободные радикалы, которые инициируют свободнорадикальное окисление. Свободные ра-

дикалы рекомбинируются с образованием неустойчивого тетроксида, распадаю-

щегося с выделением кванта света. Хемилюминесценцию измеряли на биохеми-

люминометре БХЛ-06М. Оценивали содержание свободных радикалов по све-

тосумме свечения (S) и максимальной интенсивности сигнала (Imax), а также со-

стояние антиоксидантной системы по коэффициенту k (Imax / S). Результат изме-

рялся в импульсах/с. Исследование выполнялось на базе лаборатории клиниче-

ской биохимии и генетики ФГБУ ИвНИИ М и Д Минздрава России. Выражаю благодарность с. н. с. Ситниковой О. Г.

Определение концентрации нитротирозина проводили набором фирмы

«HBT» (Нидерланды) иммуноферментным методом на автоматическом ридере

EL-808 (BIO-TEK INSTRUMENTS INC., USA). Результат выражался в нмоль/мл или нмоль/г. Исследование выполнялось на базе лаборатории клинической био-

химии и генетики ФГБУ ИвНИИ М и Д Минздрава России. Выражаю благодар-

ность н. с. Поповой И. Г.

Определение концентрации васкулоэндотелиального фактора (VEGF-С)

в крови проводилось иммуноферментным методом с применением набора BioVendor (Чехия) на автоматическом ридере EL-808 (BIO-TEK INSTRUMENTS INC., USA). Результат выражался в пг/мл. Исследование выполнялось на базе ла-

боратории клинической биохимии и генетики ФГБУ ИвНИИ М и Д Минздрава России. Выражаю благодарность н. с. Поповой И. Г.

Г) ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЦЕНТЫ.

Для гистологического исследования плацент по наибольшему периметру, из

центральной части органа, иссекали биологический материал. Маркированные

76

кусочки фиксировали в нейтральном забуференном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Готовые срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Ис-

следование выполнялось на базе лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии ФГБУ ИвНИИ МиД Минздрава России. Выражаю благодарность зав. лабораторией, профессору Перетятко Л. П.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась стан-

дартным пакетом статистических программ STATISTIKA-6,0 (StatSoft, Inc.) с ис-

пользованием критерия Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка W

для оценки нормальности распределения. Достоверность отличий данных, подчи-

няющихся нормальному распределению, определяли с помощью t-критерия Сть-

юдента. Если характер распределения отличался от нормального, то сравнение средних величин проводили с помощью Т-критерия Уилкоксона и U-критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

В таблицах и тексте результаты представлены в форме Х ± Sх, где X -

среднее арифметическое выборки; Sх - ошибка средней арифметической.

77

Глава 3 ВЛИЯНИЕ ОКСИДА АЗОТА И АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА НА ПОКАЗАТЕЛИ

КРОВИ КРЫС ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И ПРИ НАРУШЕНИИ МАТОЧНО-ПЛАЦЕНТАРНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ

У небеременных животных на 20-й день введения нитрита натрия, L-NAME,

альфа-токоферола содержание эритроцитов, концентрация гемоглобина, показа-

тель гематокрита находятся на уровне исходных значений (табл. 3). Однако, кон-

центрация ретикулоцитов у крыс, получавших нитрит натрия, выше контрольных цифр и составляет 37,6 ± 1,85‰ при 26,5 ± 1,75‰ у интактных животных.

Таблица 3

Показатели периферической крови и морфометрические индексы эритроцитов у небеременных крыс

Примечание: * - достоверное отличие от 1-й группы (р<0,05).

78

Из морфометрических индексов понижен только средний объем у 3-й и 7-й

групп животных: 59,7 ± 1,54 мкм3 (нитрит) и 59,4 ± 1,36 мкм3 (токоферол) при

65,7 ± 1,36мкм3 в контрольной группе (см. табл. 3).

У интактных беременных крыс на 20-й день показатели красной крови,

кроме ретикулоцитов, достоверно снижаются по сравнению с первым днем бере-

менности: количество эритроцитов от 7,78 ± 0,11 Т/л до 5,91 ± 0,18 Т/л, концен-

трация гемоглобина от 147,0 ± 2,04 г/л до 118,3 ± 4,62 г/л, гематокрит от 50,7 ± 1,04% до 38,2 ± 1,35% (табл. 4). Содержание ретикулоцитов меняется в противо-

положную сторону – оно повышается от 26,5 ± 1,75‰ до 35,4 ± 1,73‰. Поступле-

ние с питьевой водой нитрита натрия в течение 20-ти дней не влияет на содержа-

ние эритроцитов, гемоглобина, гематокрит, но вызывает ретикулоцитоз – концен-

трация молодых эритроцитов повышается от 35,4 ± 1,73‰ до 45,3 ± 3,09‰ (см.

табл. 4) Введение L-NAME, альфа-токоферола в течение такого же срока не при-

водит к существенным изменениям показателей.

У ложнооперированных крыс содержание эритроцитов, гемоглобина, гема-

токрит достоверно не меняются (табл. 5). При НМПК из описываемых показате-

лей достоверно снижается только концентрация гемоглобина от 118,3 ± 4,62 г/л (у

интактных беременных крыс) до 106,4 ± 1,96г/л (НМПК). Ведение антагониста

NO на фоне НМПК приводит к достоверному повышению уровня гемоглобина до

113,2 ± 3,87 г/л (на 7% по сравнению с НМПК) и повышению среднего содержа-

ния гемоглобина в эритроците от 18,8 ± 0,38 пг до 20,8 ± 0,64 пг, по сравнению с изолированным L-NAME повышается концентрация ретикулоцитов от 30,4 ± 1,54‰ до 40,3 ± 4,10‰ (см. табл. 5). Введение донатора NO и альфа-токоферола на фоне НМПК не вызывает существенных изменений периферической крови по сравнению с изолированным введением нитрита натрия и альфа-токоферола. При этом имеется существенная разница по сравнению с изолированным НМПК (см.

табл. 5). При введении нитрита натрия на фоне патологии беременности выше концентрация гемоглобина на 11%, гематокрит – на 18%, относительная концен-

трация ретикулоцитов на 37%. Также достоверно увеличены ССГЭ и СОЭр. При

79

сравнении введения альфа-токоферола на фоне НМПК и изолированного НМПК достоверно повышается только гематокрит.

Таблица 4

Показатели периферической крови и морфометрические индексы эритроцитов у беременных крыс

Примечание: * - достоверное отличие 1-й группы от 2-й группы (р < 0,05);

#- достоверное отличие 2-й группы от 4, 6, 8-й групп (р < 0,05).

80

Таблица 5

Показатели периферической крови и морфометрические

индексы эритроцитов у крыс с НМПК

Примечание: ° - достоверное отличие 2-й группы от 10-й группы (р < 0,05);

# - достоверное отличие 10-й группы от 11, 12, 13-й групп (р < 0,05); * - досто-

верное отличие 11, 12, 13-й групп от 4, 6, 8-й групп соответственно (р < 0,05).

При оценке у небеременных крыс уровня NOx и нитротирозина, активности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты, выявлено, что на 20-

й день поступления нитрита натрия концентрация NOx и нитротирозина досто-

верно повышается от 144,5 ± 6,30 мкМ и 3,35 ± 0,44 нМ до 193,0 ± 18,6 мкМ

(34%) и 5,07 ± 0,31 нМ (52%) (табл. 6, рис. 1). Показатели ХЛ также существенно