диссертации / 10

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Н.И. ПИРОГОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

__________________________________________________________________

На правах рукописи

УСАНОВА Елена Алексеевна

Прогностическое значение изменения секреции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите

14.03.03 – «Патологическая физиология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМТН

Ю.В. Балякин

Москва 2014

2

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………….....6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...13 1.1. Современные представления о патогенезе острого деструктивного панкреатита……………………………………………………………........................13

1.1.1. Участие полиморфно-ядерных лейкоцитов в патогенезе острого деструктивного панкреатита....…………………………………………............17 1.1.2. Механизмы инфицирования и микробиологический пейзаж при остром деструктивном панкреатите…………………………………….........................20

1.2.Современные возможности прогнозирования течения острого деструктивного панкреатита…………………………………………………………………………....25

1.3.Механизмы регуляции кислородозависимого метаболизма полиморфно-

ядерных лейкоцитов……………………………………………………………..........31

1.4. Методы исследования кислородозависимого метаболизма полиморфно-

ядерных лейкоцитов……………………………………………………………..........36

1.5. Заключение по обзору литературы................…………………………………...41

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………...42

2.1. Клиническая характеристика пациентов с острыми деструктивными панкреатитами...…………………………………………………………….................44 2.2. Используемые материалы……………………………………………………......45

2.3.Методы…………………………………………………………………………....46 2.3.1. Метод приготовления бактериальных комплексных антигенов на целлофановом диске...……………………………………………………...........46

2.3.2.Приготовление разведений бактериальных комплексных антигенов………………………………….……………………………...............47

2.3.3.Метод выделения полиморфно-ядерных лейкоцитов из цельной венозной крови……………………………………………………......................49

3

2.3.7.Определение секреции супероксид анион радикала кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами методом люцигенин-зависимой хемилюминесценции………………………………………………………….....53

2.3.8.Определение влияния условий инкубации in vitro на полиморфно-

3.2.Изучение влияния условий инкубации in vitro на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите……………………………………………………....................................61

3.3.Изучение влияния бактериальных комплексных антигенов на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в норме……………………………………………………………………………...........65

3.3.1.Праймирующее влияние комплексного антигена Escherichia coli на

секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами

4

3.3.2. Праймирующее влияние комплексного антигена Staphylococcus aureus

на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в норме………………………………………………………………….....70 3.3.3. Праймирующее влияние комплексного антигена Klebsiella pneumoniae

на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в норме………………………………………………………………….....75

3.3.4.Праймирующее влияние комплексного антигена Pseudomonas aeruginosa на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в норме…………………………………………………….81

3.4.Изучение влияния бактериальных комплексных антигенов на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите…………………………………………….....................86

3.4.1.Изучение влияния комплексного антигена Escherichia coli на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите………………………………………….....86

3.4.2.Изучение влияния комплексного антигена Staphylococcus aureus на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите……………………………......92

3.4.3.Изучение влияния комплексного антигена Klebsiella pneumoniae на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите……………………………......98

3.4.4.Изучение влияния комплексного антигена Pseudomonas aeruginosa на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите………………………………104

3.5. Прогностическое значение исследования изменения секреции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром деструктивном панкреатите…………………………………………………………………………..111 3.5.1. Динамическое исследование суммарной секреции активных форм кислорода и секреции супероксид анион радикала кислорода полиморфно-

5

ядерными лейкоцитами крови больных острым деструктивным панкреатитом..……………………………………………………….................111 3.5.2. Динамическое исследование праймирующего влияния бактериальных комплексных антигенов на секрецию активных форм кислорода полиморфно-

ядерными лейкоцитами крови больных острым деструктивным панкреатитом..……………………………………………………….................113

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………...120

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….125

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………………….126

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………….127

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………...129

ПРИЛОЖЕНИЕ……………………………………………………………………...147

6

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

В хирургической практике острый панкреатит (ОП) в 20-40% случаев носит деструктивный, некротический характер [3; 88; 100; 114]. В настоящее время экс-

периментальными исследованиями доказано, что активированные полиморфно-

ядерные лейкоциты (ПМЛ) одними из первых иммунных клеток обнаруживаются в очаге панкреодеструкции [141; 154; 155]. Считается, что они являются важны-

ми компонентами в защите и ограничении повреждения ткани поджелудочной железы. Однако ряд недавних научных исследований свидетельствует и о нега-

тивной роли ПМЛ в патогенезе острого деструктивного панкреатита (ОДП). Ин-

фильтрируя ткань поджелудочной железы и секретируя активные формы кисло-

рода (АФК) в ходе респираторного взрыва, нитроксиды и гидролитические фер-

менты, ПМЛ способны вызывать локальное повреждение железы, способствуя прогрессированию процессов деструкции [143; 155]. Коллектив зарубежных авто-

ров в своей работе показал, что ПМЛ участвуют в регуляции апоптоза в панкреа-

тоцитах при экспериментальном панкреатите [140]. Существует точка зрения, что ПМЛ, находясь в микроциркуляторном русле под действием «цитокинового шторма», приходят в состояние гиперстимуляции и, мигрировав в очаг деструк-

ции, «перевыполняют» там свои эффекторные функции, оказывая не защитное, а

повреждающее действие. По мере развития ответной противовоспалительной ре-

акции, ПМЛ приходят в состояние иммунодепрессии, тем самым способствуя усугублению ОДП и инфицированию очагов панкреатогенной деструкции [77].

Установлено, что инфицирование очагов повреждения при экспериментальном панкреатите осуществляется за счет бактериальной транслокации флоры кишеч-

ника и происходит уже в первые сутки от начала заболевания [118]. Между тем,

клиническое проявление гнойно-септических осложнений ОДП наблюдается только на 10 - 14 –е сутки заболевания [98; 101; 118]. Наиболее часто высеваемы-

ми возбудителями при инфицировании ОДП по данным литературы являются

Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus и Pseu-

7

domonas aeruginosa [59; 120]. Вопрос, в силу каких причин в одном случае у больных ОДП протекает асептично и разрешается, а у других усугубляется инфи-

цированием и развитием гнойно-септических осложнений, остается до сих пор нерешенным. Учитывая, что основное количество летальных исходов при ОДП связано с развитием гнойно-септических осложнений, изучение процессов инфи-

цирования и поиск ранних маркеров является одной из актуальных задач совре-

менной медицины [Приводится по: 88].

С нашей точки зрения, позитивное или негативное влияние ПМЛ на процес-

сы деструкции в поджелудочной железе могут быть связаны с нарушениями про-

цессов прайминга этих клеток. Существование такой способности у ПМЛ, как прайминг или предстимуляция, известно еще с 80-х годов прошлого века. Суть данного явления заключается в том, что действие праймирующего стимула на клетку не приводит к ее непосредственной активации, а вызывает развитие повы-

шенной функциональной готовности клетки, что влечет за собой усиление интен-

сивности ответа (например, повышенную секрецию АФК на последующее добав-

ление этого же или другого стимула [35; 50; 82]. Также важно отметить, что при возникновении воспалительного процесса в макроорганизме ПМЛ приходят в со-

стояние предстимуляции еще в кровеносном русле, под действием находящихся там праймирующих факторов. Далее, мигрируя в очаг воспаления, там они реали-

зуют все свои эффекторные функции, в т. ч. и секрецию АФК.

На сегодняшний день известно много праймирующих факторов: различные химические вещества, физические факторы, препараты цитокинов, миелопепти-

ды, микроорганизмы и их компоненты [23; 54; 64; 82]. В ряде работ исследовали праймирующее действие бактерий или их антигенов на фагоцитарную активность ПМЛ крови при различных инфекционных заболеваниях и у здоровых людей

[17]. Однако чаще всего это было воздействие каким-то одним выделенным ком-

понентом бактерий, являющимся патоген-ассоциированным молекулярным пат-

терном (РАМР) данного микроорганизма, – липополисахаридом, пептидоглика-

ном либо токсином [116; 131]. В организме же, при воспалении бактерии исполь-

8

зуют все свои факторы патогенности, инвазии, токсины, выделяют продукты жиз-

недеятельности. Именно поэтому в данной работе была смоделирована in vitro си-

туация, схожая с той, которая создается in vivo при попадании микроорганизма и возникновении воспалительного процесса. Для этого в качестве праймирующего стимула использовали комплексные бактериальные антигены, состоящие из инактивированных цельных микроорганизмов, их разрушенных компонентов, и

выделенных ими продуктов жизнедеятельности.

Таким образом, изучение праймирующей способности ПМЛ, проявляющейся изменением секреции АФК, in vitro имеет патофизиологическое значение in vivo.

Между тем, процессы прайминга ПМЛ при ОДП остаются неизученными, что и обусловило актуальность настоящей работы. Изменение функционального потен-

циала ПМЛ, его возможное потенцирование открывает новые возможности для предупреждения гнойно-септических осложнений различных острых воспали-

тельных заболеваний.

Цель исследования

Исходя из выше изложенного, целью настоящей работы явилось исследова-

ние механизмов изменения секреции активных форм кислорода полиморфно-

ядерными лейкоцитами при остром деструктивном панкреатите.

Задачи исследования

Для достижения поставленной нами цели потребовалось выполнить следую-

щие задачи:

1.Отработать условия определения секреции активных форм кислорода поли-

морфно-ядерными лейкоцитами крови в норме.

2.Выявить изменения секреции активных форм кислорода полиморфно-

ядерными лейкоцитами при асептическом и инфицированном течении острого деструктивного панкреатита.

9

3.Изучить влияние бактериальных комплексных антигенов на секрецию актив-

ных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами в норме.

4.Оценить особенности секреции активных форм кислорода полиморфно-

ядерными лейкоцитами крови под влиянием бактериальных комплексных ан-

тигенов при асептическом и инфицированном течении острого деструктивного панкреатита.

5.Разработать прогностический алгоритм определения характера течения остро-

го деструктивного панкреатита на первые сутки заболевания по изменению секреции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами кро-

ви.

Научная новизна

Установлено влияние условий инкубации in vitro и подтверждена роль ком-

понентов цельной крови в механизмах секреции АФК на ПМЛ крови в норме.

Впервые выявлено праймирующее влияние комплексных антигенов Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa на секрецию АФК ПМЛ крови в норме.

Установлено, что у пациентов с инфицированным течением ОДП уже в 1-е –

3-е сутки заболевания наблюдается снижение суммарной секреции АФК и сек-

реции О2ˉ ПМЛ крови по сравнению с пациентами, имеющими в дальнейшем асептическое течение заболевания.

Впервые выявлено снижение праймирующей способности ПМЛ к секреции АФК в ответ на воздействие инкубацией при 37˚С в течение 60 мин и комплекс-

ными антигенами микроорганизмов, способных вызвать инфицирование у паци-

ентов с гнойно-деструктивными формами острого панкреатита. Установлено, что одним из механизмов снижения секреции АФК ПМЛ крови является нарушение активности НАДФН-оксидазы.

10

Теоретическая значимость работы

Значимость исследования заключается в расширении представлений об уча-

стии ПМЛ в патогенезе ОДП, в частности их роли в развитии инфицирования очагов панкреодеструкции на ранних сроках заболевания.

Практическая значимость работы

На основании полученных экспериментальных данных установлена возмож-

ность использования метода стимулированной сульфатом бария люминол-

зависимой хемилюминесценции крови в прогнозе течения ОДП уже в 1-е сутки заболевания. Снижение секреции АФК ПМЛ крови при воздействии комплекс-

ными антигенами Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa может являться ранним специфическим маркером инфи-

цирования при ОДП.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для получения результатов по определению эффекта прайминга ПМЛ in vitro, приближенных к условиям in vivo, необходимо производить исследова-

ния по изучению секреции АФК ПМЛ на цельной крови.

2.Предварительная инкубация при 37˚С в течение 60 мин оказывает прайми-

рующее влияние на секрецию АФК ПМЛ в норме. У пациентов с ОДП та же инкубация вызывает снижение секреции АФК ПМЛ. При инфицированном течении ОДП одним из механизмов является нарушение активности НАДФН-

оксидазы ПМЛ.

3.Комплексные АГ Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae

и Pseudomonas aeruginosa оказывают праймирующее влияние на секрецию АФК ПМЛ в норме и при асептическом течении ОДП. Данное влияние опреде-

ляется активацией НАДФН – оксидазы ПМЛ.

4.При инфицированном течении ОДП секреция АФК ПМЛ снижена. При воз-

действии комплексными АГ Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella