332_p1466_C1_7726

ФОТОСИНТЕЗ

Фотосинтез – наиболее мощный процесс преобразования солнечной энергии в свободную энергию органических соединений. Для осуществления этого уникального процесса в ходе эволюции был создан фотосинтетический аппарат, содержащий: 1) набор фотоактивных пигментов, способных поглощать определенные области электромагнитного излучения и запасать эту энергию в виде энергии электронного возбуждения; 2) специальный аппарат преобразования энергии электронного возбуждения в разные формы химической энергии (АТФ, НАДФН2), которая затем преобразуется в свободную энергию органических молекул.

Основные термины и понятия, необходимые для изучения

Хлоропласты, тилакоиды, граны, строма, ламеллы. Фотосинтетические пигменты: хлорофиллы, каротиноиды, фикобилины; сопряженная система связей, П-электроны, вакантные орбитали, способы дезактивации возбужденного состояния хлорофилла. Хроматическая адаптация. Светособирающие комплексы, реакционные центры, элентрон-транспортные цепи, АТФ-синтазный комплекс, водорасщепляющий комплекс. Фотофизический, фотохимический и энзиматический этапы световой фазы. Фотосистемы: принцип работы, характеристика переносчиков, причины создания протонного градиента. Виды фотофосфорилирования: циклический, нециклический, псевдоциклический.

Темновая фаза фотосинтеза: метод меченых атомов, фиксация углекислого газа, разнообразие путей восстановления СО2: цикл Кальвина, цикл Хэтча – Слэка, САМ-метаболизм, фотодыхание (линейное и циклическое), причины и условия фотодыхания, преимущество растений С4-типа перед растениями С3-типа.

Работа 1 ПИГМЕНТЫ ЗЕЛЕНОГО ЛИСТА

Фотосинтез, т. е. образование органических веществ из углекислоты и воды с использованием световой энергии, происходит в зеленых пластидах – хлоропластах. В состав хлоропластов высших растений входят следующие пигменты:

3

хлорофилл «а»: C55H72O5N4Mg – зеленый с синеватым оттенком, хлорофилл «б»: C55H70O6N4Mg – зеленый с желтоватым оттенком, каротин: C40H56 – желто-оранжевый,

ксантофилл: C40H56O2 – золотисто-желтый.

Все эти пигменты нерастворимы в воде, но растворимы в органических растворителях (спирте, ацетоне и др.). Задача данной работы – получение спиртовой вытяжки из зеленых листьев и ознакомление с некоторыми физико-химическими свойствами пигментов.

Извлечение пигментов

Листья любого комнатного растения нарезать в фарфоровую ступку и растереть с небольшим количеством этилового спирта, прибавив на кончике скальпеля СаСО3 (для нейтрализации кислот клеточного сока). Носик ступки с наружной стороны смазать вазелином. После небольшого отстаивания зеленый раствор осторожно по палочке слить в воронку с сухим фильтром. Оставшуюся в ступке густую массу снова растереть со спиртом. После отстаивания жидкость перенести на фильтр. Эту операцию повторить несколько раз, пока раствор не станет бесцветным. С полученной вытяжкой провести ряд опытов.

Опыт 1. Флуоресценция хлорофилла

Флуоресценция – это явление свечения веществ при поглощении ими света. При этом в большинстве случаев излучаемый свет имеет длину волны большую, чем поглощаемый. Флуоресценция – это признак фотохимической активности вещества.

Вытяжку пигментов поместить на черном фоне у электролампы (лучше синего цвета), рассмотреть окраску вытяжки в отраженном свете. Вишнево-красный цвет вытяжки в отраженном свете свидетельствует о способности хлорофилла флуоресцировать. Объяснить, почему зеленый лист не флуоресцирует, а экстрагированный хлорофилл флуоресцирует.

Опыт 2. Разделение пигментов по Краусу

Этот метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине.

В пробирку налить 2–3 мл спиртовой вытяжки, прибавить примерно полуторный объем бензина и несколько капель воды для того, чтобы спирт не смешивался с бензином. Пробирку накрыть и

4

несколько раз сильно встряхнуть, а затем дать 2–3 мин постоять. При этом происходит разделение слоев: верхний зеленый слой (бензиновый) содержит оба зеленых пигмента и каротин, а нижний желтый слой (спиртовой) содержит ксантофилл.

Опыт 3. Омыление хлорофилла и отделение каротина

В пробирку с 2–3 мл вытяжки прибавить несколько капель 20 % спиртового раствора щелочи. Налить 1–1,5 мл бензина и 2 капли дистиллированной воды. Сильно встряхнуть, а затем дать отстояться.

Нижний спиртовой слой содержит соль хлорофилловой кислоты (продукт омыления хлорофилла) и ксантофилл. Верхний бензиновый слой – каротин.

Можно произвести омыление и после разделения слоев по Краусу. Прибавляя в ту же пробирку кусочек едкого калия, встряхнуть и наблюдать обратное размещение слоев.

Уравнение реакции хлорофилла со щелочью:

СООСН3 СООNa

MgN4OН30С32 + 2NaOH = MgN4H30OC32 + C20H39OH + CH3OH

COOC20H39 COONa

Объяснить, почему происходит изменение окраски слоев.

Опыт 4. Получение феофитина и восстановление ме- таллорганической связи

В пробирку налить 2–3 мл спиртовой вытяжки и добавить 1–2 капли 10 % HСl. При взбалтывании вытяжка становится бурой вследствие образования производного хлорофилла – феофитина (в хлорофилле атом магния замещается водородом). Реакция идет по следующему уравнению:

СООСН3 СООCH

MgN4OН30C32 + 2HCl = N4OH32C32 + MgCl2

COOC20H39 COOC20H39

5

К побуревшей вытяжке прибавить несколько кристалликов уксуснокислого цинка или меди, осторожно нагреть и наблюдать появление зеленой окраски благодаря восстановлению металлорганической связи.

Какие биологические функции выполняет феофитин?

Работа 2 РАЗДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЕТОДОМ

БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Метод основан на распределении пигментов между целлюлозой хроматографической бумаги и подвижной фазой – растворителями. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движутся растворители, молекулы пигментов, нанесенные на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения. Чем выше растворимость пигмента, тем дальше он продвигается по бумаге вместе с растворителем и, наоборот.

Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу пигментом в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным пигментом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. В стандартных условиях эта величина для данного пигмента постоянна и соответствует его коэффициенту распределения.

Ход работы. Взять навеску листьев 0,5 г. Мелко нарезать в ступку, добавить щепотку обезвоженного сернокислого натрия, несколько капель смеси ацетон-спирт (в соотношении 3:1), все тщательно растереть до однородной массы.

Добавить еще этой же смеси и отфильтровать. Ступку и растертую массу несколько раз ополоснуть этой же смесью, до тех пор, пока масса не обесцветится. Общий объем фильтрата измерить и записать.

Приготовить хроматографическую бумагу размером 15х20 см, и, отступив от краев по 2 см, провести простым карандашом линию. Приколоть бумагу кнопками к штативу для хроматограммы и по проведенной линии нанести пипеткой 2 мл фильтрата, но не сразу, а в несколько приемов.

В хроматографический цилиндр налить 15 мл смеси: петролейный эфир-бензин-ацетон (425 мл петролейного эфира – 25 мл бензина – 50 мл ацетона). Хроматограмму свернуть трубочкой и

6

опустить в цилиндр; сторона, на которую нанесен фильтрат, должна быть внизу. Цилиндр закрыть крышкой и поставить на разгонку. Когда фронт растворителя дойдет до верхней границы (на 2 см ниже края бумаги), хроматограмму вынуть, высушить феном. В результате того, что пигменты различно адсорбируются

хроматографической бумагой, они располагаются в следующей последовательности: хлорофилл «б», над ним хлорофилл «а», затем ксантофиллы, а выше каротины, поднимающиеся с фронтом растворителя (рис. 1).

Рис. 1

Работа 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ

ЗЕЛЕНЫХ ПИГМЕНТОВ

Данная работа является продолжением работы № 2. На полученной хроматограмме обвести простым карандашом зоны, соответствующие пигментам хлорофиллам «а» и «б» и вырезать их ножницами. Полоски разрезать на мелкие кусочки и поместить их в бюксы для элюирования (экстрагирование с хроматограммы) и залить 5 мл смеси ацетон–спирт. Элюировать пигменты в течение 5–7 мин. Полученный элюат колориметрировать на фотоэлектроколориметре, используя красный светофильтр. В качестве стандартного раствора использовать раствор Гетри, окраска которого соответствует окраске раствора, содержащего 85 мг/л хлорофилла. Из исходного раствора Гетри последовательным разбавлением приготовить серию стандартных растворов, определить для них на ФЭКе с красным светофильтром коэффициент пропускания (Т). Коэффициент пропускания показывает, какая часть световой энергии проходит через раствор. Он меняется в пределах от 100 до 0 % (за 100 принимается интенсивность света, прошедшего через растворитель). На основании полученных данных строят калибровочный график. На оси абсцисс откладывают концентрацию растворов в мг/мл, на оси ординат – соответствующие значения коэффициента пропускания в процентах.

Определив на ФЭКе коэффициент пропускания полученного

7

элюата, найти по калибровочной кривой, какой концентрации он соответствует. Для этого из отмеченной на оси ординат экспериментально полученной точки провести прямую линию, параллельную оси абсцисс, до ее пересечения с калибровочной кривой. Из этой точки пересечения опустить перпендикуляр на абсциссу. Точка пересечения перпендикуляра с абсциссой соответствует концентрации определяемого раствора.

Содержание зеленых пигментов рассчитать по формуле:

X = CmV nν ,

где Х – содержание зеленых пигментов во взятой навеске сырых листьев, мг;

С – концентрация пигментов, найденная по калибровочной кривой, мг/мл;

V – общий объем экстракта, мл; v – объем элюата, мл;

m– навеска листа, взятая для анализа, мг;

n– объем вытяжки, нанесенный на хроматограмму, мл. Определив содержание зеленых пигментов во взятой навеске,

необходимо рассчитать в процентах долю пигментов от массы листа. Эта цифра и будет являться конечным результатом проведенной работы.

Работа 4 ОБНАРУЖЕНИЕ ФОТОСИНТЕЗА МЕТОДОМ

КРАХМАЛЬНОЙ ПРОБЫ НА ЗЕЛЕНОМ ЛИСТЕ

В процессе фотосинтеза клетками зеленого листа в хлоропластах обычно вырабатывается крахмал. Задача работы: доказать, что необходимыми условиями для выработки листом крахмала в процессе фотосинтеза являются свет и доступ углекислоты воздуха.

Лист растения (предварительно выдержанный в течение 3 суток в темноте для обескрахмаливания), поставленный черешком в маленькую баночку с водой, поместить в стеклянный сосуд с воздухом, обогащенный СО2; этот сосуд выставить на свет для образования крахмала в результате процесса фотосинтеза.

По окончании опыта лист обработать спиртом для удаления хлорофилла, а образовавшийся крахмал проявить раствором йода в йодистом калии.

Ход работы. Наполнить маленькую банку водой доверху и

8

поставить в воду лист, предварительно подрезав черешок под водой. Для защиты листа от света наложить плотно на верхнюю и нижнюю поверхности листа два пробковых кружка, точно один против другого; закрепить их на листе, проткнув булавкой. Произвести пробное опускание банки с листом на дно большой банки (при помощи длинного пинцета или тигельных щипцов), добившись быстрого и правильного выполнения этого приема. Поставить опыт в одном из следующих вариантов.

1.Налить на дно большой банки 15 мл 1 % раствора двууглекислой соды. Влить туда же 5 мл 4 % раствора серной кислоты и быстро опустить маленькую банку с листом на дно большой. Последнюю немедленно закрыть пробкой.

2.Для прекращения доступа СО2 через устьица половину листа, свободную от пробковых кружков, покрыть тонким слоем вазелина с верхней и нижней поверхностей (осторожно, не повреждая листа).

На дно большой банки налить 15 мл 1 % раствора двууглекислой соды и прилить туда же 5 мл 4 % раствора серной кислоты. Быстро опустить маленькую банку с листом на дно большой и немедленно плотно закрыть пробкой.

3.Для освобождения воздуха в большой банке от СО2 налить на ее дно 20 мл воды, в которую бросить кусочек КОН (2–3 г).

Закрыв банку пробкой, поболтать содержимое 1–2 мин. Затем открыть пробку и быстро опустить маленькую банку с листом на дно большой и немедленно снова закрыть плотно пробкой.

Поставить собранную установку на лист белой бумаги на расстоянии 8-10 см от электрической лампы в 250–300 Вт. Лист в банке должен быть обращен своей поверхностью к лампе. Заметить время. Лист под лампой держать в течение 45–50 мин.

За это время сделать записи, зарисовки, подготовить оборудование для дальнейшей работы и проделать следующую работу: обнаружение зерен крахмала в хлоропластах листа. Для этого взять живые листья мха мниум (или элодеи), выдержанные предварительно несколько часов при хорошем освещении; обработать их непосредственно на предметном стекле раствором йода в концентрированном растворе хлоралгидрата в течение нескольких минут. Хлоралгидрат разрушает хлорофилл и просветляет лист.

При рассмотрении препарата под микроскопом можно видеть окрашенные йодом в синий цвет крахмальные зерна, часть которых расположена внутри хлоропластов.

9

Разобрать установку и освободить лист от пробковых кружков. Придерживая пинцетом черешок листа, опустить его в кипящую воду на 2–3 мин.

Убитый таким образом лист положить для обесцвечивания в колбу со спиртом; спирт довести до кипения.

Обесцвеченный лист положить на фарфоровое блюдце и залить его небольшим количеством раствора йода в йодистом калии для проявления крахмала.

Зарисовать распределение крахмала в листе и объяснить полученные результаты крахмальной пробы в зависимости от варианта опыта.

Работа 5 ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ УСЛОВИЙ

НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ФОТОСИНТЕЗА ВОДНОГО РАСТЕНИЯ

Для определения интенсивности фотосинтеза водных растений можно использовать метод счета пузырьков кислорода. На свету в листьях происходит процесс фотосинтеза, продуктом которого является кислород, накапливающийся в межклетниках. При срезании стебля избыток газа начинает выделяться в виде непрерывного тока пузырьков, быстрота образования которых зависит от интенсивности фотосинтеза. Данный метод не отличается большой точностью, но зато очень прост и дает наглядное представление о тесной зависимости процесса фотосинтеза от внешних условий.

Ход работы. Поместить веточку элодеи с неповрежденной верхушечной почкой в кювету с водой и сделать срез острой бритвой для устранения возможности закупорки путей при выходе газа. Погрузить веточку срезом вверх в пробирку с водой, предварительно обогащенную углекислотой путем растворения небольшого количества соды (перед погружением веточки внести в пробирку на кончике ножа NaHCO3 и взболтать). Помещая пробирку с веточкой элодеи в те или иные условия, подождать, пока установится равномерный ток пузырьков, перевернуть песочные часы и подсчитать количество пузырьков, выделенных за определенное время. Используя в качестве источника света настольную лампу мощностью 100–200 Вт, проделать следующие опыты.

1. Влияние освещенности. Налить воду, нагретую до 30 ºС, в

10