ДНК-нанотехнологии 1 введение и основные методы / ДНК-нанотехнологии 1 введение и основные методы

6

ДНК-нанотехнологии 1: введение и основные методы

[S1] ДНК-нанотехнология, которая использует ДНК в качестве строительного материала, превратилась в одну из самых важных отраслей нанотехнологии. Являясь основной молекулой в процессах биологической наследственности, ДНК также является отличным строительным материалом для точно спроектированных наноструктур [1].

[S2] Что же обеспечивает ей такую применимость? Во-первых, структура двойной спирали ДНК, она же двуцепочечная структура ДНК, хорошо известна, её диаметр составляет около 2 нм, а расстояние между основаниями составляет 3,4 Å; периодичность спирали составляет 10 пар нуклеотидов на один виток. Во-вторых, ДНК обладает высоко программируемыми и предсказуемыми межмолекулярными взаимодействиями благодаря принципу комплементарности азотистых оснований: аденин комплементарен тимину, гуанин – цитозину [2]. В-третьих, синтетические олигомеры (олигонуклеотиды) ДНК с разработанными последовательностями и предпочтительными модификациями для проектирования разных нуклеотидных последовательностей являются коммерчески доступными. В-четвертых, ДНК можно манипулировать и модифицировать с помощью большого набора ферментов, включая ДНК-лигазы, эндонуклеазы рестрикции, киназы и экзонуклеазы. Наконец, ДНК несёт код, который может быть прочитан белками и нуклеиновыми кислотами [1]. Эти характерные особенности делают ДНК перспективным материалом для нанотехнологий, образуя тем самым новое направление этой области – ДНК-нанотехнологию.

[S3] Эра ДНК-нанотехнологий была начата после того, как 1982 году Надриан (Нед) Симэн (американский специалист по нанотехнологиям и кристаллографии) и его коллеги впервые предложили правила построения так называемых разветвлённых узлов ДНК [3] на основании принципа комплементарности азотистых оснований (или принципа сопряжения оснований Уотсона-Крика). Развитию ДНК-нанотехнологии способствовал растущий спрос, который, в свою очередь, облегчил разработку новых функциональных материалов, удовлетворяющих огромный спрос в биологических и медицинских областях применения, таких как тканевая инженерия и терапия. ДНК-нанотехнология постепенно стала бурно развивающейся областью в материаловедении и инженерии [4].

[S4, пояснять на слайде] В целом, как универсальные молекулярные строительные блоки для создания функциональных материалов, топологии искусственных полимерных цепей ДНК включают линейные, кольцевые и разветвлённые типы. Топология ДНК – это способ описания специфических конфигураций (структур), то есть пространственных расположений атомов и химических связей между ними, сложных молекул с целью описаниях их поведения и природы. Способ основан на привлечении раздела математики – топологии.

[S5] Если с линейным и кольцевым типом кажется, что всё понятно, то про разветвлённый необходимо пояснить. Разветвлённый тип ДНК (англ. branched (type) DNA (сокр. bDNA)) возникает, когда три и более дезоксинуклеотидных цепей, они же одноцепочечные ДНК (англ. сокр. ssDNA), вступаю в комплементарные взаимодействия (сцепки) между собой, то есть они начинают сцепляться между собой своими азотистыми основаниями в согласии с принципом комплементарности азотистых оснований. То характерное место, где одноцепочечная ДНК переходит от сцепки с одно одноцепочечной ДНК в сцепку с другой, называется перекрёстком или узлом (англ. a junction), также иногда под разветвлением ДНК понимаю разрыв двуспиральной структуры, называемой двуцепочечной ДНК (англ. сокр. dsDNA), на одноцепочечные (ДНК).

Линейная и круговая ДНК – наиболее распространённые формы ДНК, существующие в природе. Линейная ДНК является самой простой формой для разработки и синтеза, поэтому она обычно используется в качестве базовой единицы для организации различных наноматериалов. Кольцевая ДНК может служить основой для создания архитектур ДНК, таких как ротаксаноподобные структуры ДНК и ДНК-нанотрубки. Однако использование кольцевой ДНК в качестве строительных блоков все ещё имеет определённые ограничения.

При рациональном проектировании мономеры разветвлённой ДНК могут создавать чётко определённые и высокоупорядоченные двумерные (2D) или трёхмерные (3D) наноструктуры из ДНК путём самосборки липких концов, такие как дендример (или арборол), массив, полиэдр (многогранник), кристалл и гидрогель. С точки зрения функций и применения, мультивалентные ветви наделяют разветвлённую ДНК способностью конъюгировать (соединяться) с различными функциональными компонентами (молекулами), называемыми ДНК-гибридами, что позволяет использовать её в различных областях биоматериалов и биомедицины.

[S6] В целом, характеристики разветвлённой ДНК включают следующее: (1) они могут выступать в качестве инициаторных ядер или растущих строительных блоков для создания гиперразветвлённых наноструктур ДНК контролируемым образом; (2) последовательности в разветвлённой ДНК могут быть рационально разработаны в соответствии с желаемыми требованиями; и (3) индивидуальные липкие концы в разветвлённой ДНК обеспечивают множество модифицированных участков для соединения с конкретными функциональными молекулами. Из этого ясно, что разветвлённая ДНК не только обладает свойствами общих материалов ДНК, такими как программируемость, манипулируемость, прецизионность, способность молекулярного распознавания и биологическая функция, но также имеет преимущества регулируемости размера, многовалентности и контролируемой симметрии.

Таким образом, разветвлённая ДНК постепенно становится привлекательным, универсальным и перспективным строительным блоком для создания очень сложных архитектур из ДНК.

Способы создания ДНК-систем основаны на сопряжении азотистых оснований и образовании химических связей ДНК с различными веществами и сложными молекулярными комплексами. Способы, основанные на сопряжении оснований, делятся на статическую и динамическую самосборку, а способы, основанные на химических связях, используют различные синтетические молекулы не нуклеиновых кислот, что может служить точками ответвления для создания разветвлённой ДНК, такие как металлоцентрированные комплексы, дисульфидные виды и органические молекулы (можно прокомментировать [S6]).

[S7] Пройдёмся кратко по этим методам. В статической самосборке ДНК-системы образуются путём сцепки олигонуклеотидных цепей частично комплементарных друг другу. Каждая нить обычно содержит двуцепочечную область и удлинённый липкий конец. Скрещенные двуцепочечные области используются для стягивания комплементарных одноцепочечным ДНК для поддержания жёсткости и стабильности структур. Кроме того, гибкие липкие концы могут удлинять разветвлённую ДНК в ДНК-сети или соединять несколько функциональных элементов.

[S8] Динамическая самосборка основана на методе, носящим название «катализируемая сборка шпилек» (англ. catalyzed hairpin assembly) (сокр. КСШ). Здесь шпилькой (англ. stem-loop, или hairpin, или hairpin loop) называется ДНК-структура, которая образуется в том случае, когда две последовательности одной и той же цепи комплементарны друг другу и соединяются друг с другом, перегибаясь одна к другой и образуя на конце неспаренный участок – петлю [5]. Этот метод позволяет собирать и разбирать, образующиеся структуры. В пути сборки и разборки участвуют одноцепочечный инициатор и несколько метастабильных мономеров шпильки. Инициатор, присоединяясь к одной из таких шпилек раскрывает их, что приводит к запуску каскада реакций раскрытия шпилек. В результате разветвлённая ДНК формируется путём каскадного раскрытия метастабильных шпилечных цепей, запускаемых инициатором.

[S9] Перейдём теперь к структурам, основанным на химических связях. Первым будут металлоцентрированные комплексы. Как было показано некоторые переходные металлы способны создавать точки ответвления в разветвлённых ДНК. С их помощью был получен класс металлоразветвлённых комплексов ДНК с правильной геометрической формой с помощью твердофазного синтеза – метода получения продуктов химического синтеза взаимодействием твёрдых реагентов без участия растворителей. (Реакции твердофазного синтеза локализованы на поверхности частиц твёрдых реагентов, а их скорость зависит от формы и размера частиц, определяется диффузией ионов в объёме реагентов или продуктов и не может быть выражена изменением концентрации реагентов.) А также метод, разработанный для получения, белков, пептидов, ДНК и других органических веществ [6]. В качестве переходного металла использовалось сложное соединение, содержащее рутений (Ru). Включение переходного металла в разветвлённую ДНК наделяет комплексы адресной конфигурацией, повышенной стабильностью, интенсивной флуоресценцией и окислительно-восстановительной активностью.

Следующий метод связан с использованием дисульфидных видов (пара цистеинов в белке с дисульфидной связью) органических соединений со структурой радикал – сера – сера – радикал, скреплённые одинарными связями (R–S–S–R’) [7]. Дисульфидные виды ведут себя как стабильные и ковалентные связи и с их помощью удалось сцепить две одноцепочечные цепи различных двуцепочечных ДНК, которые впоследствии сформировались в разветвлённые ДНК.

Структуры из ДНК на основе органических молекул – следующий метод их сборки. Методы соединения разветвлённой ДНК с органическими молекулами обычно делятся на три категории, а именно: твердофазная фосфорамидитная химия, химическое копирование по шаблону и реакции кросс-сочетания. Эти способы также позволяют создавать сложные ДНК-архитектуры: от многогранников до сложных кристаллоподобных сетей и решёток.

[S10] Последний метод – метод ферментативного расширения (англ. enzymatic extension). Он основан на том, что ДНК-структуры формируются в полимеразной цепной реакции, в процессе которой добавляются различного рода добавки, в основном сложная органика, что приводи к образованию различного рода ДНК-архитектур.

Впоследствии, эти методы применяют для конструирования разнообразных целевых структур, определяемые разработчиком (проектировщиком): от сеток для культивирования микроорганизмов до биоэлектронных устройств.

(Мотив (или мотив последовательности) – это короткие повторяющиеся последовательности нуклеотидов или аминокислот, например, в ДНК [8]. Как предполагается, они имеют биологическую функцию. Часто они указывают на специфические для последовательности места связывания, присоединения белков, таких как нуклеазы и факторы транскрипции.)

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Sun L, Yu L, Shen W. DNA nanotechnology and its applications in biomedical research. Journal of Biomedical Nanotechnology. 2014 Sep;10(9):2350-2370. DOI: 10.1166/jbn.2014.1930. PMID: 25992461.

2. https://inep.sfedu.ru/wp-content/uploads/ehamt/learn/nano-biology/lek_6.pdf

3. Seeman, N. C. (1982). Nucleic acid junctions and lattices. Journal of Theoretical Biology, 99(2), 237–247. doi:10.1016/0022-5193(82)90002-9

4. Dong, Yuhang, et al. "DNA functional materials assembled from branched DNA: design, synthesis, and applications." Chemical Reviews 120.17 (2020): 9420-9481. (https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.chemrev.0c00294)

5. https://en.wikipedia.org/wiki/Stem-loop

6. https://old.bigenc.ru/chemistry/text/4184514

7. https://en.wikipedia.org/wiki/Disulfide

8. D'haeseleer, P. What are DNA sequence motifs?. Nat Biotechnol 24, 423–425 (2006). https://doi.org/10.1038/nbt0406-423