КР3

Векторы для трансформации растений на основе Ri-плазмид. Ri-плазмиды вызывают усиленное образование корней и, также как Ti-плазмиды, приводят к синтезу опинов. Однако Ri-плазмиды в большинстве случаев не онкогенны, и после трансформации растительные клетки способны регенерировать здоровые плодовитые растения. В настоящее время на основе Ri-плазмид также получены векторы для генной инженерии растений.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Наиболее удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК и рассматриваются главными кандидатами на роль векторов для переноса генов в растения. Наиболее перспективным в этом отношении является вирус мозаики цветной капусты CaMV, поражающий в основном растения семейства Капустных. Частицы этого вируса имеют диаметр около 50 нм и содержат кольцевую ДНК длиной 8000 н. п. Небольшой размер генома CaMV дает возможность манипулировать in vitro с вирусной ДНК, как с бактериальной плазмидой и затем вводить ее в растения путем втирания в листья. Инфицирование небольшого числа клеток приводит к заражению всего растения, так как вирус быстро распространяется, передаваясь от клетки к клетке. Использованием 1–5 мкг ДНК для инфицирования одного растения достигается почти 100%-я эффективность инфекции, что значительно выше, чем при агробактериальном заражении. Прямая интеграция не показана. Разработан методический прием – агроинфекция, позволяющий осуществить прямое встраивание вирусной ДНК после инокуляции. Для этого геном CaMV встраивается в Т-ДНК и в ее составе интегрирует в ядерный геном различных растений, при этом из состава CaMV вырезаются последовательности, обеспечивающие его вирулентность. К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие: малый размер генома, что дает возможность легко манипулировать вирусной ДНК; высокая копийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50000 на клетку); наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов. Среди недостатков следует отметить небольшую емкость вектора (800–1000 н.п.) и ограниченный круг хозяев – крестоцветные.

Векторы на основе мобильных элементов (транспозонов). Метод основывается на том, что мобильные элементы могут после первичной интеграции в хромосому растений перемещаться по геному путем встраивания и последующего вырезания. Наиболее широко для растений используется система Ac/Ds векторов. Ac – это мобильный элемент растений способный вызывать хромосомные разрывы в специфических участках генома кукурузы. Ас-Элемент относится к группе мобильных элементов, способных к активным транспозициям по геному. Ас-элемент может быть активен в геномах других растений. Недавние эксперименты по исследованию закономерностей транспозиции Ас-элемента показали возможность использования конструкций на основе Ас-мобильного элемента для получения систем маркированных транспозиций, а также для создания так называемых линий ловушек генов, позволяющих идентифицировать новые гены, в том числе и группу генов, имеющих тканеспецифичную экспрессию, т. е. тех, которые транскрибируются и транслируются не во всех, а только в определенных тканях. Использование в таких векторах репортерных генов позволит маркировать новые сайты интефации транспозонных конструкций и идентифицировать те места инсерций, которые произошли около или непосредственно в последовательность функционального гена, для его последующего клонирования и секвенирования