ПРИКЛАДНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ. Учебное пособие

соединяются с ним с образованием неактивного фермент-субстрат- ингибиторного комплекса ESI, что может быть описано следующей кинетической схемой:

Запишем уравнение материального баланса по ферменту, в котором в данном случае будет три слагаемых:

[ ] [ ]0 = [ ] + [ ] + [ ] = [ ] + [ ] (1 + )

[ ]0 = [ ] + [ ] + [ ]

Выразим отсюда [E] и подставим в выражение константы Михаэлиса:

Теперь выразим отсюда [ES] и преобразуем выражение в форму, похожую на уравнение Михаэлиса-Ментен:

21

Рис. 10б. Бесконкурентное ингибирование в обратных координатах.

На этом графике прямые Лайнуивера-Бэрка идут параллельно, так как изменяются как максимальная скорость, так и константа Михаэлиса, причем оба параметра пропорционально уменьшаются и тангенс угла наклона прямой в итоге не изменяется. Уменьшение Км говорит об увеличении сродства фермента к субстрату, но это происходит за счет непродуктивного связывания в неактивный комплекс ESI и в итоге скорость уменьшается.

Часто встречается бесконкурентное аллостерическое ингибирование, т.е. связанное с воздействием на регуляторный аллостерический центр фермента, не имеющий отношение к активному центру и часто удаленный от него, но присоединение ингибитора ведет к изменению формы молекулы фермента и ухудшению пространственного соответствия с молекулой субстрата. Часто ингибирование ферментов производят продукты ферментативных реакций, что препятствует синтезу избытка продукта (регуляция по принципу обратной связи):

ФЕРМЕ

CУБСТРАТ ПРОДУКТ

23

При этом роль ингибитора может играть не обязательно продукт работы данного фермента, как, например, глюкозо-6-фосфат для гексокиназы:

Конечный продукт всей цепочки превращений может подавлять активность первого фермента цепочки или катализирующего лимитирующую (самую медленную), часто необратимую стадию цпроцесса, как, например, β-гидрокси-β-метилглутарилкоэнзим А редуктаза ингибируется холестерином, в синтезе которого играет лимитирующую роль:

холестерин

Следует отметить,что кинетические исследования предполагают минимальную степень конверсии субстрата в продукт, чтобы исключить влияние обратимости или ингибирование продуктом, и вид графика Лайнуивера-Бэрка будет отклоняться от линейности лишь при несоблюдении этого условия и накоплении в смеси существенных количеств продукта.

Иногда может наблюдаться и ингибирование субстратом. При этом на графике зависимости скорости от концентрации субстрата в области больших концентраций происходит уменьшение скорости, и на графике будет наблюдаться максимум.

Субстратное ингибирование (ингибирование избытком субстрата) можно рассматривать в качестве частного случая бесконкурентного ингибирования. Помимо изменения свойств среды

24

при больших [S] причиной такого явления может быть образование неактивного комплекса с двумя молекулами субстрата ES2 и тогда субстрат фактически играет роль бесконкурентного ингибитора, а кинетическая схема весьма похожа на рассмотренную:

Здесь Ki – константа ингибирования субстратом, то есть константа диссоциации двойного фермент-субстратного комплекса. Проведем для этого случая вывод уравнения Михаэлиса-Ментен:

= 2[ ]

= 2[ ]01[ ][ ] = −1[ ] + 2[ ]

[][] = −1 + 2 = [ ] 1

Запишем уравнение материального баланса по ферменту, в котором в

данном случае будет три слагаемых:

[ ] [ ]0 = [ ] + [ ] + [2] = [ ] + [ ] (1 + 2)

Выразим отсюда [E] и подставим в выражение константы Михаэлиса:

Теперь выразим отсюда [ES] и преобразуем выражение в форму, похожую на уравнение Михаэлиса-Ментен:

25

При этом на графике Лайнуивера-Бэрка в области больших концентраций субстрата наблюдается отклонение от линейности.

Для того, чтобы найти [S], соответствующую минимуму, продифференцируем обратную скорость (обозначим ее y) по обратной концентрации (обозначим ее x). В точке экстремума производная обращается в ноль. Исходя из этого находят концентрацию субстрата, при которой кривая имеет минимум [Smin]:

[ ] = √

= [ ]2

Непосредственно по графику рассчитать Ki невозможно, т. к. на первом участке кривой зависимость не является линейной. Однако в точке минимума на графике Лайнуивера-Бэрка производная d(1/V)/d(1/[S]) обращается в ноль. Отсюда следует, что Ki = [Smin]2 / Km. Это дает возможность рассчитать константу ингибирования исходя из точки экстремума на графике.

Впрочем, следует заметить, что ингибирование субстратом – нечастое явление, физиологический смысл которого не вполне ясен (как полагают, это может предотвращать чрезмерный синтез биологически активных продуктов при больших концентрациях субстрата).

Кинетические параметры реакции определяются экстраполяцией линейного участка графика в области малых концентраций до пересечения с осями, как и в обычном случае.

Иногда наблюдается, наоборот, активация субстратом (рис. 12).

27

Рис. 12. Активация фермента субстратом.

Обычно это бывает для ферментов, содержащих несколько активных центров (например, НАД-зависимые лактатдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа дрожжей состоят из четырех субъединиц с четырьмя активными центрами). Тогда присоединение первой молекулы субстрата облегчает присоединение второй и так далее. Этот эффект называется кооперативным. Он проявляется в белках четвертичной структуры и, в частности, характерен для присоединения кислорода к гемоглобину, содержащему четыре гема. В этом случае на графиках зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, построенных в прямых координатах, наблюдается S-образная зависимость, похожая на кривую диссоциации оксигемоглобина.

4.3. Смешанное (mixed) ингибирование

Нередко наблюдается смешанное (mixed) ингибирование, когда ингибитор взаимодействует и с самим ферментом, и с ферментсубстратным комплексом. При этом константы диссоциации (ингибирования) обоих комплексов могут и не совпадать. Это описывается следующей кинетической схемой:

28

Сделаем вывод уравнения Михаэлиса-Ментен для этого случая:

[ ][ ]1 = [ ]

[ ][ ]

2 = [ ]= 2[ ]

= 2[ ]01[ ][ ] = −1[ ] + 2[ ]

[][] = −1 + 2 = [ ] 1

Запишем уравнение материального баланса по ферменту, в котором в данном случае будет четыре слагаемых:

Выразим отсюда [E] и подставим в выражение константы Михаэлиса:

29

Теперь выразим отсюда [ES] и преобразуем выражение в форму, похожую на уравнение Михаэлиса-Ментен: