Основы клеточной и генетической инженерии (90

После того, как выделенные фрагменты ДНК соединены в пробирке, их надо ввести в живые клетки. Для этого используют специальные молекулы – векторы.

Ключевой операцией в генетической инженерии является введение в

клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК. Это достигается при помощи векторов.

Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации.

Для переноса генетической информации используются плазмиды и бактериофаги (вирусы), называемые векторами. Плазмиды – это внехромосомные, автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов в молекулярно-генетических исследованиях.

Бактерии имеют определенное преимущество над высшими формами, а именно:

число многоклеточных животных в экспериментах ограничено сотнями или в лучшем случае несколькими тысячами, а их жизненный цикл длится неделями или месяцами;

в экспериментах на бактериях можно использовать большое их число с жизненным циклом меньше часа;

бактериальная клетка построена значительно проще клетки эукариот.

Бактериальная клетка, которую можно видеть под электронным микроскопом, снаружи покрыта клеточной стенкой с клеточной мембраной, окружающей протопласт. Внутри такая клетка имеет ядерную область (ДНК) и цитоплазму (рибосомы). Хромосомы бактерий, которые не отделены оболочкой

11

от цитоплазмы, представлены двунитевыми, реже однонитевыми молекулами, а в ряде случаев – только молекулами РНК. Генетический аппарат образован единственной кольцевой хромосомой, лишенной основных белков-гистонов.

Бактерии размножаются бесполым путем – делением клетки надвое, некоторые бактерии делятся очень часто, каждые 20 минут. Через несколько часов колония состоит уже из миллионов генетически идентичных бактерий, образующих клон. У бактерий Е. coli существует примитивная форма полового размножения, сущность которого заключается в одностороннем переносе генетического материала – эписомы из одной клетки в другую при их конъюгации. Выделены мужские бактерии F+ и женские F-. Во время полового процесса бактериальная клетка F+ конъюгирует с клеткой F- и передает ей свой генетический материал.

Следует отметить, что половой фактор (F-фактор), который содержат только мужские клетки, представляет собой маленькую добавочную хромосому, состоящую из ДНК. Половой фактор F+ получил название плазмиды, которые являются саморепродуцирующимся генетическим элементом. При репликации мужские клетки дают только мужские.

При конъюгации по цитоплазматической трубке F+ переходит в женскую F- клетку, вследствии чего она превращается в мужскую.

Среди популяций клеток F+ возникают клетки, способные к высокой частоте рекомбинаций. Такие клетки были названы Hfr. В этих клетках фактор Hfr находится в интегрированном состоянии и представляет собой уже часть бактериальной хромосомы и реплицируется как ее часть. Включенный в бактериальную хромосому фактор Hfr реплицируется вместе с ней и при конъюгации с женскими клетками последние не превращаются в F+ клетки.

Плазмиды характеризуются различными функциями. Наиболее изучены три типа плазмид: факторы генетического переноса, факторы стойкости бактерий к лекарствам и колициногены.

Факторы генетического переноса – это не что иное, как половой фактор

F, обуславливающий при конъюгации перенос генов. Бактерии, содержащие

12

плазмиды этого типа, служат генетическими донорами. Кроме того, они способны скрещиваться с клетками, не содержащими плазмиды.

Факторы стойкости к лекарствам, контролируют синтез ферментов,

придающих бактериям устойчивость к антибиотикам, сульфаниламидам и другим лекарственным веществам.

Вбактериях также имеются факторы генетического переноса, вследствие чего такие плазмиды могут проникать в бактериальные клетки не только своего, но и другого вида, а также и покидать клетку. Стабильное сохранение плазмиды в клетке возможно если она содержит факторы устойчивости к конкретному виду лекарств, например, к определенному антибиотику.

Вэтом случае в колонии или клоне сохраняются только бактериальные клетки, несущие данную плазмиду.

Колициногенный фактор содержит гены, вызывающие синтез особых белковых веществ – колициногенов. Плазмиды, относящиеся к рассматриваемому типу автономно реплицируются в цитоплазме и передаются при делении клетки её потомкам и могут проникать в другую бактерию своего или другого вида. В большинстве случаев бактерии содержат только плазмиду.

В1974 году был предложен один из первых плазмидных векторов E.coli – Col E 1. Этот вектор является самым простым и имеет лишь один сайт узнавания рестриктазы Eco R 1.

Плазмида ColE1 относится к группе колициногенных факторов, обеспечивающих у E.coli синтез антибиотика колицина. Плазмида E.coli представляет собой небольшую кольцевую молекулу ДНК, расщепляемую рестриктазой Eco R 1 только в одном месте. Данная плазмида служит основой для конструирования новых производных векторов.

Другим плазмидным вектором E.coli является плазмида pSC 101. Она содержит ген устойчивости к тетрациклину, имеет лишь один сайт узнавания рестриктазы Eco R 1. В отличие от плазмиды Col E 1 при её расщеплении рестриктазой Eco R 1 гены устойчивости к антибиотику не затрагиваются.

13

Плазмиды E.coli – Col E 1 и pSC 101 представляют интерес не только при изучении развития начальных этапов генетической инженерии, но они стали основой для разработки современных схем получения рекомбинантных молекул (рис. 4)

Рис.4 - Схема образования рекомбинационной молекулы ДНК с помощью

рестриктазы E.coli RI и ДНК-лигазы (Б.П. Завертяев, 1989)

Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток – небольшая емкость.

В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7 - 8 т.п.н., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (10 - 25 т.п.н.). Плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т.п.н.) нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеции (выпадения) нуклеотидов чужеродной ДНК.

Для клонирования больших фрагментов ДНК используются фаговые векторы – космиды (рис. 5). Космиды представляют собой гибридную молекулу, содержащую специальный cos – участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага λ, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Космиды могут включать до 40 т.п.н. чужеродной ДНК, и при этом активно амплифицироваться в E.coli как плазмиды.

14

АБ

Рис.6 - Схематическое изображение фага Т4 (А), Встраивание профага в

бактериальную хромосому (Б), В.Ф. Красота, 1994

Бактерия, несущая профаг, называется лизогенной. Она, приобретая свойства фага, обладает способностью к размножению и созданию на протяжении ряда поколений клонов.

Задание: изучить инструменты генетической инженерии, их свойства, применение.

Задание №1: провести сравнительную характеристику ферментов, используемых в генетической инженерии для создания рекомбинантнызх ДНК. Задание выполнить по форме таблицы №2, наличие или отсутствие тех или иных операций отмечать знаками « + », « - ».

16

Задание №2: ответить на поставленные вопросы.

1.Дать определение вектору. Какой вектор является самым простым, предложенным одним из первых в данном качестве.

2.Какие векторы используют для клонирования больших фрагментов ДНК?

3.В каких единицах измеряется ферментативная активность рестриктаз?

4.Плазмиды, их свойства и требования предъявляемые к ним.

Задание №3: зарисовать схему образования рекомбинантных молекул ДНК.

Задание №4: отметить отличительные признаки бактерий и многоклеточных форм, используемых в генетической инженерии. Задание выполнить по форме таблицы №3, наличие или отсутствие тех или иных свойств отмечать знаками « + », « - ».

Таблица 3. - Отличительные признаки бактерий и многоклеточных форм

Домашнее задание: изучить особенности полового размножения у бактерии

E.coli.

17

ТЕМА 2. НОВЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ ЖИВОТНЫХ

2.1 Создание трансгенных организмов

Цель занятий. Изучить способы получения животных и растений с новыми хозяйственно-полезными качествами. Выявить положительные стороны и недостатки трансгенных и химерных организмов, клонированных животных.

Мощное развитие животноводства за последние десятилетия привело к появлению выдающихся пород животных. Продуктивность молочного скота у некоторых пород достигла 8-9 тыс.кг. Новый сибирский тип российской мясошерстной породы овец отличается высокой мясной и шерстной продуктивностью. Средняя масса племенных баранов составляет 110-130 кг,

средний настриг шерсти в чистом волокне 608 кг. Лучшие породы кур дают по 400 яиц в год на несушку, а бройлерные цыплята достигают массы 2,5 - 3 кг за семь недель. Примеры выдающихся достижений селекции можно перечислять очень долго. Однако нас больше интересует вопрос о том, какие новые методы селекции используются для непрерывного совершенствования животных. Таких методов много, остановимся на некоторых из них. Посмотрим, для примера, как осуществляется селекционный процесс у молочного скота. Комплекс селекционных приемов, используемых в молочном скотоводстве, называется крупномасштабной селекцией. Она обеспечивает очень эффективный отбор производителей, создание больших запасов замороженной спермы от выдающихся быков, отбор и эффективное использование лучших коров. Методы гормональной суперовуляции и трансплантации позволяют получать от лучших коров десятки зигот в год и выращивать их в коровах, имеющих более низкую племенную ценность. Вся система управляется из единого информационного центра. Такая широкомасштабная селекция позволяет повышать продуктивность породы на 1-2% в год. Это очень высокий показатель для таких медленно размножающихся животных, как крупный рогатый скот.

18

Создание продовольственного потенциала, как в мире, так и в нашей стране базируется на использовании потенциала сортов растений и пород животных, полученных в процессе селекции. Другими словами, наше благополучие напрямую связано с уровнем развития и эффективностью селекции, что и определяет ее особую значимость для человечества. Хотя человек и освоил под сельское хозяйство всего 10% суши нашей планеты, но увеличить значительно долю пахотных земель сегодня невозможно, так как все доступные на сегодня резервы пригодных для сельского хозяйства земель фактически исчерпаны. Остается одно – значительно увеличить отдачу используемых земель, резко повысить продуктивность растений и животных. За предшествующие 100 лет в деле улучшения растений и животных селекция сделала поразительные успехи. Сегодня во многих развитых странах получают рекордные урожаи пшеницы, риса, кукурузы. Считается, что конечный результат в растениеводстве на 50% зависит от уровня урожайности сорта, на такую же величину от совершенства технологии земледелия и возделывания растений. Столь же внушительные результаты получены и в животноводстве. В процессе селекции созданы породы крупного рогатого скота, дающие более 10 тыс. кг молока на корову за год. Естественно, что и в животноводстве, кроме породы, большую роль играет технология содержания и кормления животных. Однако как у растений, так и у животных определяющей компонентной конечной продуктивности является биологический потенциал сортов и пород, созданный в процессе селекции.

Успехи, достигнутые в выделении генов высших организмов, их рекомбинирования с бактериальными плазмидами, интеграция чужеродной информации в животную клетку позволило разработать принципиально новый биотехнологичесикй метод по созданию животных.

Трансгенные животные – это индивидуумы, в геном которых скусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Трансген – это искусственно введенный и интегрировавшийся в ДНК животных чужеродный

19

ген. Трансгеноз – процесс переноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных .

Процесс переноса генетической информации осуществляется разными способами: микроинъекция гена, пересадка генетически трансформированных клеток в энуклеированную яйцеклетку, пересадка гена с использованием ретровируса, пересадка гена путем введения его в сперму.

Получение трансгенных животных путем микроинъекции гена включает в себя извлечение эмбриона на стадии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. ДНК в пронуклеус эмбриона вводится с помощью инъекционной пипетки (рис. 7).

Рис.7 - Схема получения трансгенных животных методом микроинъекции ДНК в оплодотворённую яйцеклетку.

1 – яйцеклетка, 2 – микроинъекция ДНК, 3 –трансфекция ДНК (искусственное введение в эукариотические клетки изолированных молекул ДНК), 4 – пересадка ядра, 5 – пересадка клетки в бластоцисту (В.С. Шевелуха, 2003).

После короткого (до нескольких часов) культивирования in vitro эмбрионы трансплантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов.

Крупному рогатому скоту пересаживают эмбрионы только после длительного культивирования (7-8 дней).

20