Биоиндикация. Микробиологические методы исследования экосистем (90

квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения (прил. 5). Зная сторону квадрата сетки, вычисляют площадь поля зрения s по формуле s = πr2.

Стандартную ошибку определяют точно так же, как указано в п. 1.1.4.

1.2.6. Анализ и обобщение полученных результатов

На основании полученных результатов по определению общей численности бактериобентоса и численности сапротрофных бактерий определяют класс качества исследуемых ДО, пользуясь справочным материалом (прил. 7). Результаты, полученные всеми рабочими звеньями, заносят в итоговую таблицу (табл. 5).

Таблица 5

Итоговая таблица по обследованному объекту

Полученные данные сопоставляют с результатами анализа проб воды. На основании комплекса проведенных исследований делают обобщенный вывод о состоянии водоема и процессах самоочищения.

21

Тема2.Оценка состояния почв

Практически все виды человеческой деятельности сопровождаются нарушением состояния окружающей среды, в том числе и почв. Основные нарушения почвенного покрова связаны с физическим, химическим и биологическим видами антропогенного воздействия. При процессах трансформации загрязняющих веществ в ходе самоочищения в почве могут образовываться не только безвредные вещества, но и еще более токсичные соединения, нежели попавшие в нее. Существенным может оказаться и комбинированное действие токсикантов, причем вещества могут вести себя и как синергисты, и как антагонисты. Изменения, происходящие в почве под влиянием различного рода загрязнений, могут повлечь за собой потерю почвенного плодородия и приобретение токсических для живых организмов свойств.

Все виды воздействий в первую очередь сказываются на микронаселении почв как наиболее чувствительном и быстро реагирующем компоненте любой экосистемы. Большинство загрязнителей влияют на численность, видовой состав и жизнедеятельность почвенной микробиоты. Они ингибируют процессы минерализации и синтеза различных веществ в почве, подавляют дыхание почвенных микроорганизмов, вызывают микробостатический эффект. Наиболее изученной к настоящему времени является реакция на загрязнение бактерий и микроскопических грибов, поэтому их чаще всего используют в качестве биоиндикаторов при мониторинге почв.

2.1. Лабораторнаяработа3

Оценка качества почв с помощью бактерий

рода Azotobacter

Одним из индикаторов состояния почв является присутствие в них азотфиксирующих бактерий, уровень жизнедеятельности которых служит объективным показателем плодородия почвы. Свободноживущие азотфиксаторы рода Azotobacter предпочитают гумусированные почвы с нейтральной реакцией среды, богатые доступными соединениями фосфора и достаточным количеством органического вещества и влаги. Химическое загрязнение

22

ведет к снижению плодородия почв и, следовательно, к снижению численности и даже полному исчезновению бактерий этого рода. В связи с этим бактерии рода Azotobacter традиционно применяются как индикаторы химического загрязнения почвы.

В данной работе используется метод оценки биологической токсичности почвы по некоторым параметрам роста бактерий рода Azotobacter: их численности, среднему диаметру колоний и коэффициенту влияния (КВ) [10, 15]. К достоинствам метода относятся простота и доступность, кроме того, он позволяет быстро дать ориентировочную оценку биологической токсичности исследуемых субстратов.

Цель работы – оценка биологической токсичности почв по некоторым показателям роста бактерий р. Azotobacter.

Задачи:

1. Определить численность бактерий р. Azotobacter в исследуемых образцах почв.

2. Определить средний диаметр колоний бактерий р. Azotobacter, выросших в посевах из разных образцов почв.

3.Рассчитать коэффициент влияния для исследуемых образцов почв.

4.На основании проведенных исследований оценить качество исследуемых почв и распределить их по мере возрастания токсичности.

Каждое звено студентов (3–4 человека) анализирует отдельный образец почвы, среди которых один образец – контрольный. Для выполнения данной работы отводится два занятия. На первом занятии студенты делают все необходимые посевы (п. 2.1.1 и 2.1.2). На следующем – обрабатывают результаты посевов: проводят подсчет численности бактерий р. Azotobacter, определяют средний диаметр колоний, рассчитывают коэффициент влияния, делают вывод о качестве исследованных почв (п. 2.1.3–2.1.5).

Порядок выполнения лабораторной работы

2.1.1. Приготовление почвенной суспензии и разведений

Для количественного учета бактерий р. Azotobacter применяют посев на твердую питательную среду из предварительно приготовленной почвенной суспензии. Поступают следующим образом.

23

Исследуемую почву помещают на часовое стекло, предварительно стерилизованное горящим спиртом. Стерильным пинцетом удаляют камни и растительные остатки. После этого взвешивают на технических весах 10 г почвы и переносят ее в стерильную ступку.

Для диспергирования почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с поверхности почвенных частиц почву подвергают специальной обработке. Берут две стерильные колбы емкостью 250 мл: одну со 100 мл водопроводной воды, другую − пустую. Подготовленную навеску почвы увлажняют до пастообразного состояния небольшим количеством стерильной воды из первой колбы и растирают 5 мин стерильным резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке, соблюдая все правила работы в стерильных условиях.

Полученную кашицеобразную почвенную массу количественно переносят в пустую стерильную колбу, многократно смывая остатки почвы со стенок ступки стерильной водой из первой колбы. Затем колбу с почвенной суспензией ставят на качалку и встряхивают в течение 10 мин. После этого суспензии дают отстояться 15 мин, чтобы осели крупные частицы, и сразу же используют для приготовления разведений (рис. 5).

Рис. 5. Приготовление разведений почвенного образца

При этом учитывают, что в полученной суспензии почва разведена в 10 раз (10:100 или 1:10). Последующие разведения готовят так же, как описано в п. 1.1.1.

24

2.1.2. Посев на питательную среду

для количественного учета бактерий рода Azotobacter

Для определения численности бактерий рода Azotobacter производят посев в чашки Петри на среду Эшби. Стерильные чашки заливают расплавленной и охлажденной до 45о С средой, слегка приоткрывая крышки. Расход среды на каждую чашку около 10–15 мл. Дают среде застыть, после чего стерильной пипеткой вносят 0,1–0,2 мл жидкости на поверхность твердой среды в середину чашки и растирают каплю стерильным шпателем Дригальского. Следует работать очень аккуратно, чтобы не повредить поверхность среды. Посевы делают из каждого разведения в двух повторностях. Чашки с посевами инкубируют в термостате 5–7 суток при 28о С.

2.1.3. Анализ выросших колоний

На среде Эшби бактерии рода Azotobacter растут в виде плоских слизистых колоний пастообразной консистенции. Характерно также пигментирование, колонии представителей рода могут быть окрашены в тёмно-коричневый, зелёный и другие цвета или же могут быть бесцветными в зависимости от видовой принадлежности.

Проводят микроскопирование нескольких таких колоний, для чего готовят препараты-мазки (прил. 2, 3).

Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные (1– 2 мкм в диаметре), обычно овальные, но обладают плеоморфизмом, то есть могут иметь разную форму – от палочковидной до сферической. На микроскопических препаратах клетки могут располагаться одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Грамотрицательные. Формируют особые покоящиеся формы – цисты, не образуют спор. В свежих культурах клетки подвижны за счёт многочисленных жгутиков. В более поздних культурах клетки теряют подвижность, приобретают почти кокковидную форму и продуцируют толстый слой слизи, формирующий капсулу клетки.

Подсчет типичных колоний и определение численности бактерий рода Azotobacter проводят точно так же, как определение численности копиотрофов при анализе проб воды. Результаты подсчета колоний заносят в таблицу, аналогичную табл. 1 (см.

25

п. 1.1.3). Для определения числа клеток в 1 г почвы (NАz , КОЕ/г почвы) проводят расчеты в соответствии с п. 1.1.4.

После подсчета колоний измеряют их диаметр. Для этого берут чашки с оптимальным числом колоний, которые использовали для определения численности бактерий рода Azotobacter. Если какая-либо колония имеет неправильную форму, то рассчитывают среднее значение ее диаметра из нескольких измерений. Результаты измерений заносят в таблицу (табл. 6).

Таблица 6

Результаты измерений диаметра колоний бактерий р. Azotobacter

После измерения диаметров всех колоний находят среднее значение диаметров (Dср) по формуле:

Dср = ( ∑di / i ) + m [мм],

где ∑di – сумма диаметров всех колонии, i – количество колоний, m –стандартная ошибка.

Стандартную ошибку определяют точно так же, как указано в п. 1.1.4.

2.1.4. Определение коэффициента влияния

Степень влияния изучаемого образца почвы на скорость роста колоний бактерий рода Azotobacter оценивают по отношению среднего значения диаметров колоний в опытных вариантах к среднему значению диаметров колоний в контроле:

КВ = Dоп / Dконтр ,

где КВ – коэффициент влияния; Dоп – среднее значение диаметров колоний в опытном образце почвы; Dконтр – среднее значение диаметров колоний в контрольном образце.

26

Если К=1, то изучаемый опытный образец почвы не оказывает влияния на скорость роста колоний тест-организма по сравнению с контрольным образцом. Если К < 1 – действие ингибирующее, при К > 1 наблюдается стимуляция. Сопоставляя коэффициенты влияния различных почвенных образцов, можно получить данные об их сравнительной токсичности.

2.1.5. Обобщение полученных результатов

Все результаты заносят в таблицу (табл. 7).

Таблица 7

Некоторые показатели роста и развития бактерий р. Azotobacter в анализируемых почвенных образцах

На основании полученных результатов по изучению популяции Azotobacter определить, какой из почвенных образцов обладает наибольшей биологической токсичностью. Установить, имеются ли среди изученных почв такие, которые снижают показатели роста и развития на 50% (LD50)8 и которые обладают биоцидными9 свойствами (LD100).

Тема3.Оценка состояния окружающей среды

с помощью санитарно­показательных

микроорганизмов

К санитарно-показательным микроорганизмам относят представителей облигатной микробиоты человека и животных, обитающих в кишечнике или респираторном тракте. С экскретами

8Летальная доза (от лат. letalis – смертельный) – доза какого-либо химического или физического агента, воздействие которой на живой орга-

низм приводит к смертельному исходу. LD50 – полулетальная (средняя летальная) доза. Один из наиболее широко применяемых показателей опасности токсичных веществ.

9Биоцидный (от греч. bios – жизнь и лат. caedo – убиваю) – уничтожающий все живое.

27

организма они попадают во внешнюю среду, где определенное время сохраняют жизнеспособность. Обнаружение санитарнопоказательных микроорганизмов в окружающей среде косвенно указывает на возможное присутствие патогенных микробов, выделяющихся из организма теми же путями. Таким образом, сани- тарно-показательные микроорганизмы являются не только индикаторами загрязнения окружающей среды выделениями человека и животных, но и показателем ее эпидемической опасности (безопасности).

Определение санитарно-показательных микроорганизмов может проводиться качественно и количественно. Качественная

оценка подразумевает определение наличия или отсутствия сани- тарно-показательных микроорганизмов. Подобные исследования проводят, когда объекты вообще не должны содержать данные микроорганизмы и когда необходим ориентировочный анализ. При количественной оценке выявляют степень обсеменения са- нитарно-показательными микроорганизмами, сравнивают ее с установленными нормативами и на основании этого дают заключение об эпидемической опасности (безопасности) исследуемого объекта [12, 13].

3.1. Лабораторнаяработа4

Оценка санитарно­гигиенического состояния объектов рабочей зоны

Объекты рабочей зоны подвергают санитарно-микробиологи- ческому обследованию, поскольку

1)их микробное обсеменение четко отражает гигиеническое состояние среды, непосредственно окружающей человека в течение рабочего дня;

2)такие объекты могут служить посредниками при передаче возбудителей многих инфекционных заболеваний.

Важнейшим источником микробного обсеменения таких объектов является человек. Большое количество разнообразных микроорганизмов попадает на них также из воздуха, возможно загрязнение насекомыми и т. п.

При санитарно-микробиологическом обследовании объектов рабочей зоны обычно устанавливают присутствие и количество санитарно-показательных микроорганизмов – индикаторов того

28

или иного вида загрязнения, тогда как их общее микробное обсеменение может представлять интерес лишь в немногих случаях.

Цель работы – оценка санитарно-гигиенического состояния различных объектов в учебных лабораториях и вспомогательных помещениях с помощью санитарно-показательных микроорганизмов.

Задачи:

1.Определить присутствие в исследуемом объекте санитар- но-показательных микроорганизмов – индикаторов воздушнокапельного загрязнения окружающей среды.

2.Определить присутствие в исследуемом объекте санитар- но-показательных микроорганизмов – индикаторов фекального загрязнения окружающей среды.

3.Определить присутствие в исследуемом объекте санитар- но-показательных микроорганизмов – индикаторов загрязнения окружающей среды разлагающимися органическими веществами.

4.На основании проведенных исследований дать предварительную санитарно-гигиеническую оценку исследуемого объекта.

Для выполнения данной работы отводится два занятия. На первом занятии студенты проводят отбор проб и делают все необходимые посевы (п. 3.1.1–3.1.2). На следующем – проводят анализ посевов и оценивают санитарно-гигиеническое состояние исследуемых объектов (п. 3.1.3–3.1.4).

Порядок выполнения лабораторной работы

3.1.1. Методы отбора проб

Наиболее простыми и удобными методами отбора проб с поверхностей являются метод смывов и метод отпечатков.

Метод смывов

Смывы производят с различных поверхностей увлажненными стерильными ватными тампонами, которые закреплены на стеклянных или металлических палочках и вмонтированы в пробирки с ватно-марлевыми пробками.

В пробирки наливают 5 мл стерильной воды (9%-го раствора NaCl или 1%-й пептонной воды) и закрывают пробками таким образом, чтобы тампоны не касались жидкости. Непосредственно перед взятием смыва тампон опускают в жидкость для увлажне-

29

ния. В процессе отбора смывов рекомендуется неоднократное смачивание тампонов.

С крупных предметов смывы берут по возможности в нескольких местах с общей площади не менее 100 см2 , тщательно протирая поверхность. Небольшие объекты протирают со всех сторон. При обследовании столовых приборов смывы берут со всей поверхности трех однотипных предметов. У тарелок протирают всю внутреннюю поверхность; у вилок, ложек, ножей протирают всю рабочую поверхность и наружный край высотой 2 см. При взятии смывов с рук увлажненным тампоном проводят по 5 штрихов по ладонным поверхностям обеих рук, включая пальцы. Затем этим же тампоном протирают межпальцевые промежутки, ногти и подногтевые пространства. После отбора проб тампон помещают в ту же пробирку, тщательно встряхивают и доставляют в лабораторию. В лаборатории проводят посевы на различные дифференциально-диагностические среды для обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов.

Метод отпечатков

Применяется для определения биологической контаминации ровной гладкой поверхности (как горизонтальной, так и вертикальной). Наиболее удобными для этих целей являются бакпечатки промышленного производства. При проведении исследования бакпечатку с требуемой плотной диагностической средой извлекают из контейнера, прикладывают поверхностью среды к исследуемому объекту и вновь вставляют в контейнер. При отборе проб с помощью этого метода никаких дополнительных посевов проводить не требуется. Использованные бакпечатки помещают в термостат. Время и температура инкубации зависит от того, присутствие какого санитарно-показательного микроорганизма требуется установить.

3.1.2.Посевы на дифференциально-диагностические среды для обнаружения санитарно-показательных

микроорганизмов

Посевы выполняют для обнаружения трех групп санитарнопоказательных микроорганизмов: индикаторов воздушно-капель- ного, фекального загрязнения и загрязнения разлагающимися органическими веществами.

30