Волознев Л.В.. Экспериментальная оценка функциональной пригодности и безопасности радиофармацевтического препарата 188Re - золедроновая кислота

11

реакции гиперчувствительности замедленного типа на 30 нелинейных мышах и исследовании реакции непрямой дегрануляции тучных клеток на 30 беспородных крысах-самцах в дозировке 0,3 мг/кг и 3,0 мг/кг по основному веществу (золедроновая кислота). Все реакции были выполнены по стандартным методикам в соответствии с «Методическими рекомендациями оценки аллергезирующих свойств фармакологических средств №98/300», одобренными Фармакологическим государственным комитетом Минздрава России (протокол № 3 от 15 апреля 1999 г.). Иммунологические свойства оценивались при изучении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов на 30 мышах-гибридах

(CBAC57BL/6)F1 массой 20-25 г в дозировке 0,3 мг/кг и 3,0 мг/кг по основному веществу (золедроновая кислота) по общепринятой методике.

Лучевые нагрузки на органы и ткани были рассчитаны из данных распределения 188Re-золедроновой кислоты в органах и тканях крыс с применением программы OLINDA/EXM версия 1.0 (Vanderbilt University, США), одобренной Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (Food and Drug Administration, FDA, USA) и Международным агентством по атомной энергии (International Atomic Energy Agency, IAEA). Лучевые нагрузки рассчитывали по методу, разработанному

Stabin M.J. et al. (Stabin M.J., 2003, 2005) при эквивалентном перерасчете экспериментальных кинетических данных с животных на человека методом

Kirschner A. et al. (Kirschner A. et al., 1975) по формуле:

где D – лучевая нагрузка (удельная поглощенная доза) целевого органа или ткани, мЗв/МБк; N – число ядерных превращений в органе, наблюдавшееся в исходной области S, с; DF – конверсионный фактор дозы, мЗв/МБк с, равный:

m

где ni – количество излучений с энергией Ei (МэВ), испускаемых за один ядерный переход в органе i с поглощенной фракцией φi; m – масса органа.

12

Все полученные данные были обработаны методами математической статистики с применением пакетов прикладных программ "OriginLab Pro 7.5" и "Microsoft Excel". Для каждого количественного признака определяли показатели среднего арифметического (М) ± стандартное отклонение. Достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованием t-

критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне значимости,

равном 5% (p=0,05), либо менее 5% (p 0,05).

2.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1.Оценка функциональной пригодности 188Re-золедроновой кислоты

Как показали результаты распределения препарата в организме крыс с моделью костной патологии, препарат обладает ярко выраженной остеотропностью и высокой скоростью выведения (таблица 2).

Таблица 2. Распределение препарата 188Re-золедроновая кислота в органах и тканях крыс-самок с моделью костной патологии после внутривенного введения (% от введенной активности на 1 грамм ткани)

Уже через 1 час после введения 188Re-золедроновой кислоты в скелете накапливается 25,7% от введенной активности. На протяжении последующих 4

часов содержание препарата в костной ткани остается достаточно высоким,

составляя 29,5%, и к пятому часу достигает максимума – 31,8%. Через 24 часа наблюдения содержание препарата в костной ткани начинает незначительно

13

снижаться и к 48 часу составляет 20,1%. Препарат быстро выводится из крови.

Через 1 час после введения его концентрация не превышает 0,5 %/мл, через 5

часов – 0,1 %/мл, а через 24 часа после введения эта величина может считаться следовой. Экскреция 188Re-золедроновой кислоты происходит через мочевыделительную систему и отличается высокой скоростью выведения

(рисунок 2). Через 1 час после внутривенного введения в среднем 38,7%

препарата выводится из организма с мочой, к третьему часу выводится до 51,4%

от введенной активности. Из организма в целом за 3 часа введения экскретируется до 60,4% от введенной активности.

Накопление препарата в области костной патологии в среднем в 3,0 раза превышает уровень накопления в здоровой костной ткани (рисунок 1). Значения коэффициентов дифференциального накопления интактная кость/костная патология 2,5-3,6, говорят о специфическом накоплении комплекса 188Re-

золедроновая кислота в очагах ремоделирования кости и дают основание предполагать накопление в метастатических очагах скелета. Эффективный период полувыведения из организма в целом составляет (Tэф.) 7,86 ч. При определении Тэф для интактной кости и кости с переломом были получены сравнимые значения – 13,87 ч и 13,40 соответственно. Однако следует принять во внимание, что при сравнимом периоде эффективного полувыведения уровень накопления препарата в костной мозоли в 2,5-3,6 раза больше, чем в интактной костной ткани, что предполагает бóльшую поглощенную дозу на моделируемый метастатический очаг.

Рисунок 1. Динамика накопления 188Re-золедроновой кислоты в очаге ремоделирования кости и интактной области

14

Рисунок 2. Функция выведения 188Reзоледроновой кислоты из организма крыс

2.2.Исследование радиотоксических свойств 188Re-золедроновой кислоты с

эквивалентной терапевтической активностью на крысах

На протяжении наблюдения в течение 30 суток после введения РФП гибели животных не зафиксировано. Разницы в поведении и состоянии животных экспериментальной группы в сравнении с животными контрольной группы не отмечено. Введение препарата 188Re-золедроновая кислота животным не привело к достоверному изменению показателей уровня гемоглобина, числа эритроцитов, тромбоцитов (таблица 3).

Содержание лейкоцитов и ретикулоцитов в крови животных в экспериментальной группе на 5–10-е сутки после окончания введения препарата

(рисунки 3, 4) было достоверно ниже (р<0,05), чем у животных контрольной группы. В те же сроки отмечен достоверный (р<0,05) сдвиг влево в нейтрофильном профиле у животных опытной группы относительно контрольных. Все отмеченные выше изменения носили обратимый характер и к

30 суткам нивелировались.

Статистически достоверных различий в активности щелочной фосфатазы,

АСТ, АЛТ, содержании альбумина, глюкозы, мочевины, общего белка,

креатинина, калия, кальция по указанным показателям между группами не выявлено.

15

* – различие в сравнении с контролем значимо по t-критерию Стьюдента (p<0,05)

На гистологических срезах печени на 15 сутки было отмечено расширение сосудов, стаз крови и выраженная пролиферация клеток ретикулогистиоцитарной системы. В красном костном мозге на 5 сутки была отмечена высокая клеточность миелоидной ткани и большое содержание сегментоядерных нейтрофилов и форменных эритроцитов. На 15 сутки сохранилось высокое содержание форменных эритроцитов, при этом сегментоядерные нейтрофилы образовали очаговые скопления. К 30 суткам гистологическая картина экспериментальных образцов не отличалась от

16

интактного контроля. Гистологические исследования костного мозга, почек и селезенки значимых изменений не показали.

2.3. Исследование токсичности компонентов для приготовления 188Re-

золедроновой кислоты на крысах

Однократное внутривенное введение раствора лиофилизата (5,4 мг/кг по основному веществу) мышам не вызвало отрицательного воздействия на поведение, физиологическое состояние и внешний вид животных.

При однократном введении раствор лиофилизата в дозировке 15,0 мг/кг крысам вызывал гибель 50% животных на 7 сутки при в/б введении. При патоморфологической оценке внутренних органов у экспериментальной группы почки были бледного цвета, рыхлые, на разрезе граница коркового и мозгового слоев практически не видна; печень была дряблая, светлая и имела мускатный рисунок. По данным патоморфологического вскрытия причиной смерти была острая почечная недостаточность. Снижение дозировки до 12,0 мг/кг и 9,0 мг/кг не вызывает гибели животных, но оказывает негативное действие на состояние печени и почек. Дозировки 6,0 мг/кг и 3,0 мг/кг, что эквивалентно двадцати- и

десятикратной дозировке для человека, не вызывают токсического действия.

При многократном введении было показано, что в дозировке 0,3 мг/кг/сутки и

0,6 мг/кг/сутки препарат не вызывал клинически значимых изменений внутренних органов и не оказывал выраженного токсического действия на крыс по данным клинико-биохимического исследования животных. По результатам гистологических исследований в группе 0,6 мг/кг на протяжении всего эксперимента в альвеолярных ходах и в межальвеолярном пространстве легких были отмечены форменные элементы крови; сосуды сердца расширены, волокна Пуркинье увеличены, типические мышечные волокна и вставочные пластины разобщены. Селезенка имела уплотненную ткань красной пульпы, заполненной форменными элементами крови, венозные синусы расширены. Также было отмечено большое количество лимфоцитов в мозговом веществе тимуса.

17

Вводимая животным дозировка 3,0 мг/кг/сутки в течение 5 дней вызывала гибель 50% животных на 6-8 стуки. По данным патоморфологического вскрытия,

клинико-биохимического анализа причиной смерти явилась острая почечная недостаточность. При патологоанатомическом вскрытии в брюшной полости находилось небольшое количество прозрачной жидкости. Почки на разрезе имели смазанный рисунок, корковый и мозговой слои плохо дифференцировались. Тимус имел неровные края и кровоизлияния.

Морфометрический анализ показал увеличение относительной массы почек и селезенки, уменьшение органо-соматического показателя (ОСП) сердца.

Остальные органы идентичны контрольным животным, значимых отличий отмечено не было. У выживших животных на 7 сутки в группе с дозировкой 3,0

мг/кг отмечалась относительная эритроцитопения (7,00±0,44×1012/л, контроль

8,10±0,23×1012/л, p<0,05), незначительное снижение концентрации гемоглобина

(130,70±7,54 г/л, контроль – 151,0±3,0 г/л, р<0,05) и уровня гематокрита

(34,60±2,32%, контроль – 40,3±1,0%, р<0,05). По данным биохимического анализа сыворотки крови выживших животных отмечалось снижение активности ЛДГ (656,0±302,0 Е/Л, контроль – 1574,5±398,5, р<0,05), увеличение активности АЛТ (29,6±0,2 Е/Л, контроль – 27,00±1,71, р<0,05), АСТ (149,7±2,02 Е/Л,

контроль – 127,50±6,38 Е/Л, р<0,05), ЩФ (891,7±364,3 Е/Л, контроль –

342,9±53,40, р<0,05), содержания мочевины (36,50±7,74 ммоль/л, контроль –

7,4±0,6 ммоль/л, р<0,05) и креатинина (91,6±13,3 ммоль/л, контроль – 75,3±5,8

ммоль/л, р<0,05). В группе с дозировкой 3,0 мг/кг были отмечены изменения со стороны сердца (рыхлая мышечная ткань, сосуды расширены, отслоенная сердечная капсула), селезенки (плотная красная и белая пульпа, насыщенная форменными элементами крови, плотные трабекулы и вены с утолщенными стенками и расширенными венозными синусами) и тимуса (дольки тимуса сжаты, междольковое вещество с большим количеством фибробластоподобных клеток). Наблюдалось токсическое влияние на почки, при этом было отмечено расширение дистального отдела коркового вещества с остатками форменных элементов крови. Полость капсулы Шумлянского расширена с неровными,

18

искривленными листками Мальпигиева тельца. По всей толщине вещества

(коркового и мозгового) наблюдалась отечность.

2.4. Исследования аллергизирующих и иммунологических свойств

Результаты исследования активной кожной анафилаксии оценивались по размеру синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения у контрольной и экспериментальной групп морских свинок; положительной реакция считается при размере пятна выше 6,0 мм, не более 3,0 мм в контроле.

Полученные данные в контрольной группе (2,70±0,33 мм < 3,0 мм) и двух экспериментальных групп в дозировке 0,3 мг/кг (3,7±0,33 мм) и 3,0 мг/кг

(6,30±0,67 мм) свидетельствуют об отсутствии положительной реакции у морских свинок. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах была положительной при дозировке 3,0 мг/кг (разница в толщине обеих лапок мышей этой группы достоверно отличается от контрольной группы – 198±26,9 и 30±10,0 соответственно, p<0,05). При исследовании меньшей дозировки (0,3

мг/кг) статистически достоверной разницы отмечено не было.

При исследовании дегрануляции тучных клеток крыс предварительно сенсибилизировали, и оценивалась реакция на предварительную внутрикожную сенсибилизацию, реакция кожи на аппликационное воздействие и провокационная проба. При изучении предварительной внутрикожной сенсибилизации и реакции кожи на аппликационное воздействие ни у одного животного не возникло патологических изменений. Через двое суток на месте провокационной пробы была выявлена слабая реакция. Процент дегрануляции тучных клеток в контрольной (3,2±0,49%) и экспериментальных группах (0,3

мг/кг – 10,3±1,11%; 3,0 мг/кг – 16,0±1,23%) не превышал 20% (реакция отрицательная).

Исследование иммунологических свойств основывалось на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов,

поглотивших частицы нейтрального красного. Результаты фагоцитарной активности макрофагов оценивались в контрольной и в двух экспериментальных

19

группах (0,3 мг/кг и 3,0 мг/кг). Согласно полученным данным, фагоцитарная активность макрофагов имеет статистически достоверное увеличение активности (p<0,05) с возрастанием дозировки в сравнении с контрольной группой (0,52±0,17 усл.ед.), активность при 0,3 мг/кг (2,72±0,16 усл.ед.) и 3,0

мг/кг (3,51±0,06 усл.ед.) больше в 5,2 и 6,7 раза соответственно.

2.5. Оценка лучевых нагрузок

Определение лучевых нагрузок производилось на основании экспериментальных данных, полученных на животных при экстраполяции на стандартизированную реалистическую модель взрослого мужчины (70,0 кг,

модель основана на данных медицинских топографических изображений).

Были рассчитаны эквивалент эффективной дозы (Effective Dose Equivalent, EDE) и эффективная доза (Effective Dose, ED). Для 188Re-золедроновой кислоты эквивалент эффективной дозы (EDE) равен 0,093 мЗв/МБк, эффективная доза

(ED) составляет 0,154 мЗв/МБк, и при вводимой терапевтической активности 45,0

МБк/кг составит в среднем 0,29 Зв и 0,48 Зв соответственно. Риск возникновения злокачественного новообразования при применении 188Re-золедроновой кислоты равен 5·10-4–5·10-3 в течение жизни, а средняя ожидаемая потеря жизни 0,1-1,0

месяца.

Высокие значения поглощенных доз (ПД) регистрируются в скелете (2,89 Гр),

почках (1,65 Гр) и мочевом пузыре (4,33 Гр) в связи с остеотропным распределением препарата и его интенсивным выведением через мочевыделительную систему. Несмотря на высокую ПД на мочевой пузырь,

значение не превышает толерантной дозы 10 Гр.

Поглощенная доза при введении 188Re-золедроновой кислоты в красном костном мозге (0,23 Гр) оказалась более чем в 10 раз меньше толерантной (2,5

Гр). Сравнивая поглощенные дозы на красный костный мозг известных терапевтических радиофармацевтических препаратов для паллиативной терапии скелета, можно видеть, что 188Re-золедроновая кислота обладает наименьшей нагрузкой в связи с коротким периодом полураспада 188Re и высокой скоростью

20

полувыведения из организма. Таким образом, можно ожидать, что миелотоксичность при терапии 188Re-золедроновой кислотой не должна выходить за рамки установленной ВОЗ допустимой гематологической токсичности.

Для расчета поглощенной дозы на моделируемый патологический очаг был использован метод расчета дозы на сферу, разработанный Stabin M.G. Konijnenberg M. Согласно полученным результатам, наибольшие лучевые нагрузки получат метастатические очаги меньших размеров, что особенно актуально при диссеминированном мелкоочаговом поражении скелета. Если масса метастатических поражений варьирует от 14,0 до 70,0 г (по данным реконструкции КТ и ОФЭКТ; Liepe K., 2003), рассчитанная поглощенная доза для 188Re-золедроновой кислоты при введении терапевтической активности 45,0

МБк/кг (и массе пациента 70 кг) для диапазона масс метастазов 14,0-70,0 г

составляет 10,2-49,9 Гр (25,0±17,0 Гр). Средняя удельная поглощенная доза на патологический очаг (модель метастатического очага) равна 7,8±5,3 мГр/МБк. Значения поглощенных доз 10,2-49,9 Гр предполагают достижение стойкого паллиативного эффекта.

Рисунок 5. Функция поглощенной дозы относительно массы метастаза для 188Re-золедроновой кислоты.

Для определения пользы от проводимой терапии и возможного риска был введен коэффициент, который косвенно прогнозирует показатель «польза–риск»