ИздательствоВоронежский государственный университетГод2016Страниц27Уровень образованияБакалавриат. Практикум по экологической токсикологии

канчик высаживают по 10 семян тест-растений, слегка заглубляя их в песок и равномерно распределяя по поверхности. Стаканчики размещают на рассеянном свету, поливая небольшими порциями дистиллированной воды по мере подсыхания поверхности песка. Полив дистиллированной водой необходим для сохранения исследуемой концентрации соли, т.к. при испарении с поверхности песка и транспирации концентрация соли увеличивается, а добавление необходимого количество дистиллята восстанавливает необходимую концентрацию.

Через 14 дней песок аккуратно высыпается на лист бумаги, и из него осторожно извлекают проросшие семена. Проростки промывают и проводят те же измерения, что и в предыдущем варианте. Заполняют таблицу. Делают выводы.

Работа № 2. Влияние солей тяжелых металлов на гликолитическую активность дрожжей

Дрожжи являются одними из наиболее изученных биологических объектов, поэтому их удобно использовать и как объекты для токсикологии. Они быстро размножаются. Их активность достаточно просто определить [4].

Материалы и оборудование: пипетки мерные на 10 мл; карандаши по стеклу; небольшие пузырьки (пенициллинки) для разведения солей; пробирки одинакового диаметра и размера; парафин; растворы солей тяжелых металлов с концентрацией 0,5 М: СuSO4 (ПДК 0,004 мг/л), Pb(NO3)2 (ПДК

0,03 мг/л), Hg(NO3)2 (ПДК 0,0005 мг/л), KMgO4 (ПДК 0,01 мг/л); препарат дрожжей (сухие дрожжи распускают в воде, добавляют сахар из расчета 5 г

на 100 мл).

Ход работы

Из первоначального раствора соли тяжелого металла методом последовательных разбавлений в 5 раз готовятся растворы с концентрацией 0,1 М, 0,02 М, 0,004 М, 0,0008 М, 0,00016 М, 0,000032 М. В качестве контроля ис-

пользуютдистиллированную воду. Этирастворысолейразливаютвпробирки по 5 мл и добавляют по 1 мл препарата дрожжей. Парафин расплавляют, и осторожно наливают в пробирки, стараясь не попадать на стенки. Когда парафин застывает, он образует плотную пробку, под которой создаются анаэробные условия. Пробирки помещают в термостат при температуре 30 оС. В этойсредедрожжисбраживаютсахар, образуяэтанолиуглекислыйгаз. Объем выделившегося углекислого газа пропорционален активности гликолиза.

Через 7 дней измеряется величина подъема пробки, которая пропорциональна объему выделившегося углекислого газа.

Результаты оформляются в виде графика зависимости подъема парафиновой пробки от концентрации соли тяжелого металла.

11

Работа № 3. Влияние солей тяжелых металлов на активность микроорганизмов почвы

Микроорганизмы – наиболее многочисленная и важная группа в почвенных биоценозах и экосистемах суши в целом. Именно разнообразные микроорганизмы минерализуют растительные и животные остатки, обеспечивая возвратразличныхэлементоввглобальныйкруговорот. Именнодеятельность микроорганизмов почвы формирует ее плодородие, переводя поступающие соединения в форму, доступную корневым системам растений. В естественных экосистемах микрофлора почвы многочисленна и разнообразна. Антропогенные примеси способны нарушать природное равновесие, способствуя угнетению одних видов и доминированию других. Кроме того, многие токсиканты ингибируют активность экзогенных ферментов, которые микроорганизмы выделяют в окружающую почву, что способствует нормальному функционированию почвенной биоты. Одним из наиболее распространенных ксенобиотиков, ингибирующих активность микроорганизмов являются тяжелые металлы [4].

Материалы и оборудование: чашки Петри, карандаши по стеклу; небольшие пузырьки (пенициллинки) для разведения солей; пипетки мерные на 10 мл; фильтровальная бумага; растворы солей тяжелых металлов с концентрацией 0,5 М: СuSO4 (ПДК 0,004 мг/л), Pb(NO3)2 (ПДК 0,03 мг/л), Hg(NO3)2 (ПДК 0,0005 мг/л), KMgO4 (ПДК 0,01 мг/л); образец почвы.

Ход работы

Из первоначального раствора соли тяжелого металла методом последовательных разбавлений в 5 раз готовятся растворы с концентрацией 0,1 М, 0,02 М, 0,004 М, 0,0008 М, 0,00016 М, 0,000032 М. В качестве контроля ис-

пользуют дистиллированную воду.

ВчашкиПетривносятслойпочвытолщиной0,5 см, затемвливаютпо9– 10 мл исследуемых солей. Поверх почвы накладывают кружок фильтровальной бумаги диаметром 5 см. Чашки подписывают и помещают в термостат при температуре 20–22 оС на 7 дней. В процессе культивирования следят за тем, чтобы поверхность бумаги не высыхала. При необходимости ее смачивают небольшим количеством дистиллированной воды, чтобы избежать изменения концентрации солей.

На следующем занятии аккуратно вынимают кружки бумаги, осторожно отмывают от комочков земли и оценивают результаты. Бактерии, разрушающие клетчатку, всегда присутствующие в почве, в результате своей жизнедеятельности выделяют окрашенные продукты. Плесневые грибки рода Аспергилл (Aspergillus) проявляют желтую окраску, а грибки рода Триходерма (Trichoderma) – темно-зеленую. По размеру и характеру окрашивания можно судить об активности микроорганизмов.

12

Изображениепятенпереноситсянакальку, иопределяетсяплощадьокрашивания.

На основании полученных результатов составляется график зависимости активности микроорганизмов от концентрации тяжелых металлов в почве. Делают выводы о том, какая соль тяжелых металлов проявляет наибольшую токсичность.

Расчетные задачи Задача 1

При сжигании угля на ТЭЦ и на мусоросжигательном заводе с золой происходит значительный выброс тяжелых металлов (таблица 3). Используя исходные данные, оцените суммарную эмиссию токсикантов по трем классам опасности (таблица 2) за расчетный период. Исходные данные приведены в таблице 1.

Чтобырассчитатьвыбростоксикантов(кг) погруппамопасностиприработе ТЭЦ используют формулу:

M1i = 30q1im1t,

где q1i – удельный выброс i-го металла, мг/кг топлива; m1 – расход угля на ТЭЦ или мусора, т/сут; t – расчетный период, мес.

Чтобы рассчитать выброс тяжелых металлов при работе мусоросжигательного завода используют формулу:

M2i = 30q2im2t,

где q2i – удельный выброс i-го металла, мг/кг топлива; m2 – масса сжигаемого мусора, т/сут; t – расчетный период, мес.

Таблица 1

Данные по расходу сжигаемого угля и мусора

13

Таблица 5

Предельно допустимые концентрации тяжелых металлов в продовольственном сырье и продуктах, мг/кг

15

Окончание табл. 5

ПЕСТИЦИДЫ

Пестициды – это химические препараты для уничтожения сельскохозяйственных и лесных вредителей. Их активное применение началось в

1940-х гг.

По направленности воздействия пестициды делят на инсектициды –про- тив энтомовредителей, фунгициды – против грибковых заболеваний, гербициды – против сорных растений, родентиды – против грызунов. Кроме того, к этой группе относят дефолианты, которые используют для удаления листьев (например, перед уборкой хлопчатника) и дефлоранты – удаляют лишние цветки (при выращивании цитрусовых).

Особенно эффективными средствами борьбы оказались хлорорганические соединения. Некоторые из них были известны уже довольно давно, однако инсектицидные свойства их были выявлены лишь в 1930–1940-х гг. Например, известный ДДТ был синтезирован еще в XIX в., но его инсектицидные свойства Мюллер обнаружил только в 1938 году. В 1948 г. ученый был удостоен за свое открытие Нобелевской премии по медицине, так как ДДТуспешно использовался дляборьбыссыпнымтифомималяриейв годы Второй мировой войны. К середине 1980-х гг. в мире было произведено около 3,5 млн т ДДТ [6, 7].

Вследствиеэтогопроизошлоповсеместноезагрязнениевсехобъектовокружающей среды остаточными количествами пестицидов. Даже в снежном покрове Антарктиды к настоящему времени накопилось более 3000 т ДДТ.

Еще в 60–70-х годах ХХ в. было показано быстрое развитие устойчивости у вредителей. В результате каждой обработки выживает незначительная часть наиболее устойчивых вредителей, которые быстро распространяются. Этоприводит к ростузатратсельхозпроизводителей, посколькунеобходимо

16

постоянно увеличивать дозу вносимых инсектицидов. Кроме того, пестициды уничтожают не только вредителя, но и другие организмы того же класса. Причем хищные насекомые являются аккумуляторами, поэтому гибнут первыми, чтодополнительноспособствуетраспространениюрастительноядных вредителей.

Пестициды оказывают нежелательное воздействие на окружающую средуиздоровьечеловека. Способывнесения(распылениесвоздуха) способствует попаданию пестицидов в все объекты окружающей среды. С 50-х годов XX в. пошлорезкоесокращениемелкихвидоврыбоядныхптиц(скопа, белоголовый орлан). Оказалось, что накопление ДДТ ведет к нарушению обмена Саиприводиткповышеннойхрупкостияичнойскорлупы, арыбоядныептицы являются сильными многоступенчатыми аккумуляторами пестицидов.

Передачахлорорганическихпестицидоввдольтрофическойцепиприводит к биомагнификации: в морских экосистемах коэффициенты биоконцентрирования ДДТ достигают 107, при этом идет активное накопление в жировых тканях промысловых рыб. В пресноводных водоемах ДДТ также очень быстро в микроводорослях. Специальными опытами было установлено, что от 50 до 80 % общего количества обнаруженного в составе помещенной в воду с концентрацией ДДТ 0,6 мкг/л водоросли хлорелла сорбировалось ею менее чем за одну минуту [6].

Хлорорганические пестициды активно накапливаются в жировой ткани человека и легко преодолевают молочный барьер, поэтому в грудном молоке жительниц Европы регистрируются определяемые концентрации ДДТ. Ежегодно в мире отмечается от 200 тыс. до 2 млн случаев отравления пестицидами.

После признания опасности ДДТ для живых организмов во многих промышленных странах в 1970-х и в начале 1980-х годов было введено резкое ограничение или даже полное запрещение применения этого инсектицида, однако мировое потребление ДДТ заметно не уменьшилось из-за роста их использования в странах Латинской Америки, Африки и Азии. Многие из этих стран вынуждены постоянно применять ДДТ для борьбы с возбудителями малярии и некоторых других опасных болезней.

Одним из главных путей распространения хлорорганических пестицидов является их миграция в атмосфере. Они испаряются с поверхности растений и переходят в атмосферу в результате выветривания почв, а поскольку пестициды обладают высокой персистентностью, загрязнение имеет глобальный характер. Из атмосферы пестициды удаляются в основном с осадками, что приводит к загрязнению почв и поверхностных вод.

Разрушение полихлорированных соединений в различных объектах окружающей среды происходит по существенно разным механизмам. В почве

17

иприродных водах происходит их микробиологическое разложение, а в атмосфере – фотохимическая деструкция [2].

Время полного исчезновения того или иного хлорорганического пестицида колеблется в широких пределах для разных климато-географических зон и в зависимости от типов почв (например, для ДДТ 240–3850 сут.).

После запрета на использование подавляющего большинства полихлорированных органических пестицидов им на смену пришли сельскохозяйственные ядохимикаты, принадлежащие к другим классам органических соединений, в частности, производные тиофосфорной кислоты.

Фосфорорганические пестициды (ФОП) применяются в сельском и лесном хозяйстве, в животноводстве, в быту с целью уничтожения разнообразных вредителей и возбудителей болезней полезных растений, паразитов животных, а также для уничтожения сорняков.

Вначале они обратили на себя внимание как боевые отравляющие вещества (в 1938 г. в Германии был синтезирован газ зарин). В конце Второй мировой войны были сделаны промышленные установки по синтезу первых пестицидов.

Всельскохозяйственноепроизводствоонибыливведеныс1965 г. взамен персистентныx и низкоэкологичных хлорорганических соединений. ФОС оказались просты в синтезе и высокоэффективны против насекомых.

В1970-е годы половина из 20 наиболее распространенных в мире инсектицидов принадлежала фосфорорганическим соединениям.

ФОС не утратили своих преимуществ и до настоящего времени [1]. Основанием к широкому использованию фосфорорганических пестици-

дов в сельскохозяйственной практике послужили, прежде всего, высокая их инсектицидная эффективность и сравнительно быстрая инактивация во внешней среде. ФОП широко применяются в теплицах при выращивании овощных культур, в животноводстве – для борьбы с эктопаразитами животных, в быту – для истребления мух, тараканов и других насекомых.

Фосфорорганические пестициды менее устойчивы во внешней среде по сравнению с хлорорганическими пестицидами и для многих из них период полураспада составляет 2–5 дней.

ФОС поступают в организм всеми путями. Легко проникают через кожу

ибиологические мембраны. При поступлении с пищей и водой могут всасываться в кровь уже в полости рта, минуя печень, и сразу попадают в большой круг кровообращения. Они легко проникают через гемато-паренхиматозный

игематоэнцефалическийбарьеры, быстродостигаютцентральныхинервномышечных синапсов и нарушают нервную регуляцию важнейших физиологических функций, в первую очередь дыхания и кровообращения [3].

18

Работа № 4. Определение токсичности хлорорганических пестицидов по разрушению хлорофилла методом высечек листьев

Хлорофилл является сложной молекулой, которая обладает высокой фотохимической активностью, однако в силу своей реакционной подвижности она довольно неустойчива. При воздействии различных токсичных веществ хлорофилл в листьях способен подвергаться различным трансформациям, которые приводят к образованию окисленных форм или полному разрушению молекулы. Это свойство хлорофилла широко используется для определения токсичности веществ. Разрушение хлорофилла легко регистрируется визуально по появлению хлорозов и некрозов [9].

Вданнойработеиспользуетсяпестицид2,4-Д(2,4-дихлорфеноксиуксус- ная кислота), который в низких концентрациях может оказывать стимулирующеедействиенарастения, аввысокойобладаетгербициднойактивностью. Разведение солей необходимо проводить в растворе сахарозы, чтобы избежать дополнительного негативного действия осмотического стресса на высечки растений.

Каждая рабочая группа (2–3 студента) использует один вид растений, таким образом, в каждой учебной группе исследуют 5–7 видов растений, что позволяет выделить наиболее чувствительные виды.

Материалыиоборудование: стерильныечашкиПетри, вкоторыеперед стерилизацией помещают по два кружка фильтровальной бумаги в каждую; пипеткимерныена10 мл; небольшиепузырьки(пенициллинки) дляразведения пестицида; раствор пестицида 2,4-Д (концентрация 10–3 %); стерильный раствор сахарозы 2 %; листья растений (уличных или комнатных, в зависимости от сезона); сверла для пробок; карандаши по стеклу.

Ход работы

Изисходногорастворапестицидаприготавливаютрабочиерастворыпутем последовательногоразведения. Дляработынеобходимоприготовитьрастворы, соответствующие 10–4, 10–5 и 10–6 %. Необходимо помнить, что все разведения проводятсиспользованиемвкачестверастворителя2 % растворсахарозы. Для тестирования каждой концентрации готовят не менее 5 чашек Петри.

Сверламидляпробокделаютвысечкиизисследуемыхлистьеврастений, не задевая крупные жилки, из расчета 10 высечек на чашку.

Чашки подписывают, указывая концентрацию пестицида и вид растения. В подписанные чашки с двумя фильтрами аккуратно, слегка приоткрывая крышку, вносят по 10 мл подготовленных растворов в каждую чашку. В одну серию чашек вносят только чистый раствор сахарозы (контроль). Далее на поверхности фильтра равномерно размещают высечки верхней стороной листа к фильтру. Чашки Петри помещают в термостат при температуре 20– 25 оС на 5–7 дней.

19

По истечении времени (на следующем занятии) чашки Петри достают из термостата, раскладывают по видам растений и концентраций и проводят оценку результатов. Для этого необходимо измерить площадь неповрежденных тканей листа в каждой чашке суммарно по всем 10 высечкам. При этом измеряют диаметр одной высечки и рассчитывают ее площадь. Затем из этой величины вычитают площадь повреждения. Затем суммируют эти величины. Операцию повторяют для каждой чашки.

Результатызаносятвтаблицуиопределяютотносительнуютоксичность пестицида для разных видов растений. Сравнивая величины относительной токсичности для разных видов растений, делают выводы о том, какой из исследованных видов является наиболее чувствительным и информативным.

Схема записи результатов

20