ЛАБОРАТОРНА РОБОТА9

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 9

Тема. Порівняльна характеристика мутантів

Мета заняття: ознайомлення студентів з основними навчальними лініями дрозофіл, які є наявні для роботи на кафедрі.

Матеріали і обладнання:  мікроскоп, пробірки з лініями мух дрозофіл (Drosophila melanogaster); набір для роботи з дрозофілою. 

Теоретичні відомості.

До органів дрозофіли, що частіше піддаються мутаційним змінам, відносяться очі, крила і щетини.

Очі нормальної мухи влаштовані за звичайним типом складних фасеточних очей комах. Складне око складається з багатьох простих очок-фасеток або омматідій (рис. 14). Число їх у самок 780, у самців близько 740. Мутації, що зачіпають різні особливості очей вельми різноманітні. Найбільш багаточисельні ті, які змінюють властиву диким мухам пігментацію ока, підсилюючи її до кольору бордо або сепії або ослабляючи до безбарвного, білого. Між ними є всілякі переходи, такі як: еозіновий, вишневий, абрикосовий, рожевий, кораловий, карміновий, багряний, винно-червоний і ін.

Велике число мутацій зачіпають форму ока, будову і розташування фасеток. У нормальної мухи фасетки розташовані на зразок вічок бджолиних сотів. У мутантів порушена правильність розташування фасеток.

Рис 14 . Форма і розташування очних фасеток і волосків.

 1 –  нормальна муха, 2 – мутант Star (зірчасті очі)

Рис 15 .Форма і розміри очей. 

1 – нормальна самка; 2 – гомозиготна самка Bar;  

3- самця Ваr; 4 – гетерозиготна самка Ваr.

Мутаційні зміни, що приводять до часткової або повної редукції очних фасеток, унаслідок чого,  поверхня ока представляється рівною і гладкою. Це   такі як: мутації Ваr (смуговидні очі), Lobe – лопатеві, eyeless – безокий і ін. У самки мутанта Ваги число фасеток в оці не перевищує 70, в Lobe або eyeless і зовсім можуть бути відсутніми (рис.15). У зв'язку з цим загальні розміри голови мух різко зменшені в порівнянні з головою нормальної мухи.

Мутаційні зміни, що зачіпають крило, умовно можна розділити на 3 групи (рис. 16-21).

Рис.16. Мутант curled (заломлені крила) Вигляд спереду і збоку.

Рис. 17. Мутант Delta (дельтоподібні  розширення подовжніх жилок потовщення  на дистальному кінці крила).

Рис. 18 . Мутант Notch (вирізки на дистальному кінці крила, III і IV подовжніх жилок).

Рис.19. Алельні мутанти серії cut. Відрізняються по мірі зазубреності крил

Рис.20. Алельні мутанти серії Vestigial. 1 - vestigial (зачаткові крила); 2 - antlered (оленерогий); 3 -    strap (смуговидні крила).

Рис.21. Мутант apterous (безкрилий)

I група. Мутанти, що модифікують загальну конфігурацію крила.

На відміну від крила нормальної мухи, що є плоским, прямим, у різних мутантів воно може бути зігнуте у вигляді арки (мутант arc), лижі (ski), закручене догори (Curly, curled), донизу (curved) або своїм положенням під час польоту нагадувати крило літака, по схожості з яким один з таких мутантів отримав свою назву (aeroplane) і так далі.

II група. Мутанти, що викликають зміни в жилкуванні крила. Ці зміни виражаються в частковому або повному зникненні однієї або декількох жилок (наприклад, crossveinless), в розвитку однієї або декількох додаткових жилок (наприклад, plexus, Delta).

III група. Багаточисельний клас мутантів, що зменшують крило в тій або іншій мірі: cut, dumpy – вирізаний, small wing – маленькі крила, rudimentary – зачаткові крила, apterous – безкрилий (рис.19-21).

Генетична номенклатура Dr. melanogaster.

В дрозофіли відмічено близько тисячі генних мутацій, що мають морфологічний, фізіологічний, біохімічний, летальний прояв; безліч хромосомних мутацій; отримані всі життєздатні типи анеуплоїдів, а також триплоїдні самки. Виникла необхідність створення спеціальної генетичної номенклатури, певної генетичної «мови», позначень і символів. Першим зведенням по генетичній номенклатурі був довідник К.Б. Бріджеса і К. Бреме, опублікований в 1914 році. Другий довідник, в якому врахований прогрес генетики дрозофіли, опублікований Д.Л. Ліндслі і Е. Греллом в 1968г.

 На основі даних цього довідника М.Д. Голубовським був проведений аналіз організації генома і фенотипного прояву мутації в дрозофіли. По мірі вивченої, чіткості прояву і легкості класифікації мутанти дрозофіли Бріджесом виділені на 5 категорій (позначені арабськими цифрами 1-5 в кінці характеристики кожного мутанта).

1. Мутанти, найбільш вивчені і інтенсивно використовувані, з чіткою класифікацією, хорошою життєздатністю і точною локалізацією. 

2. Мутанти, аналогічні мутантам першої категорії, але використовувані менш інтенсивно. Локалізовані недостатньо точно. 

3. Нечисленні мутанти з чітким проявом ознак, але локалізовані недостатньо точно.

 4. Мутанти менш зручні, але інтенсивно використовувані в спеціальних дослідженнях. Локалізовані не цілком точно. 

5. Мутанти, що виявляють трансгресію з диким типом. Локалізація недостатньо точна. 

Буква А при категорії позначає ненормальне перехрещення, зобов'язане даною аберацією.

Генні мутації

Фенотип і генотип дикого типа вважаються нормальними. Успадковані відхилення від цього стандарту називаються мутаціями. Кожній мутації дається назва, що відображає основні, найяскравіші ознаки мутантів. Назва мутації – звичайний короткий і простий прикметник (наприклад, black) або іменник (наприклад, Ваг), частіше англійське або латинське.

Для зручності кожної мутації відповідає свій символ це скорочення назви, що однозначно визначає дану мутацію. Він завжди починається з тієї ж букви, що і назва мутації, пишеться завжди курсивом і ніколи не містить грецьких букв, підрядкових підписів і проміжків між буквами. Назва і символ рецесивної мутації пишуться з рядкової букви, наприклад black, b і dumpy, dp.  Якщо мутант ознака розпізнається в гетерозиготі, то мутація "класифікується як домінантна, і її назва і символ пишуться із заголовної букви, наприклад Ваг, В і Notch, N. Алелі одного локусу мають одну і ту ж назву і символ і відрізняються один від одного відповідними індексами (дата відкриття; ініціали дослідника, скорочення назви мутації, яка використовувалася до того, як був встановлений алелізм, номер експерименту, в якому була виявлена мутація).

Мутації різних локусів, що мають однаковий фенотипний прояв, можуть мати кожна своя назва; наприклад, мутації vermilion, cinnabar, scarlet, karmosin, cardinal обумовлюють яскраво-червоний колір очей. Мутації леталі, з схожим фенотипним проявом позначаються як 1, наприклад 1 (1) 7 деталь №7 у першій хромосомі; 1(3) з деталь в третій хромосомі, що виникла в лінії ebony.

Мутації, що пригнічують прояв іншої мутації, позначаються su або Su (supressor), а підсилюючі е або Е (enchancer), далі в дужках вказують символ мутації, дія якої модифікується, наприклад su (w") або К (S). Нормальні алелі позначаються або знаком +, або з індексом плюс: b +. Знаком «–» позначають відсутність якого-небудь локусу, наприклад bb.

Дані про локалізацію мутації приводяться у такому вигляді: номер хромосоми, потім через риску місце в хромосомі. Наприклад, для white, локалізованої на 1,5 одиниці карти в I хромосомі, написане I, 1,5. В дрозофіли перша група зчеплення відповідає X хромосомі, друга і третя двом великим аутосомам і четверта маленькій аутосомі. Номери хромосом пишуться арабськими або римськими цифрами (у ранніх роботах номера хромосом позначалися римськими цифрами).

Мутації на генетичній карті локалізуються з точністю до десятих доль. Так, локалізація 3,0 одиниць карти є точнішими, ніж 3 одиниці карти. При неточній локалізації користуються знаком ±. При описі ліній, що мають декілька мутацій в одній хромосомі, символи мутація записують в порядку їх розташування на генетичній карті і розділяють проміжками, наприклад в w f В. Символи мутацій, що знаходяться в гомологічних хромосомах, розділяють похилою лінією, наприклад, в w f/b, Cy/pm.

При описі ліній, що містять мутації в негомологічних хромосомах, символи – мутацій, що належать до негомологічних хромосом, розділяють крапкою з комою і проміжком. Наприклад, в we sn; b sp. 

Список ліній мутантів Drosophila melanogaster, використовуваних на кафедрі

Д-32.  Дикий тип. 

Canton S, k-з. Дикий тип 

Bar, B, I, 57,0. Смуговидні очі. Гомозиготи життєздатні. Дуплікація (1). 

black, b, II, 48,5. Чорний. Тіло, ніжки, жилки дуже темні (1). 

brown, bw, II, 104,5. Коричневоокий. Колір очей від коричневого до гранатового (1). 

cinnabar, сn, II, 57,5. Кіноварноокий. Колір очей яскравий, шарлаховий, очки безбарвні (1).

 cut, ct, I, 20,0. Обрізаний край крила (1). 

dumpy, dp, II, 13,0. Короткокрилий. На грудях воронкоподібні поглиблення (1).

ebony, e, III, 70,7. Чорний колір тіла (1). 

scarlet, III, 44,0. Шарлаховий, багряно-червоний колір очей, очки безбарвні. (1). 

vestigial, vg, II, 67,0. Зачатковокрилий. Крила і жужжальца зачаткові (1).

 white, w. I, 1,5. Білоокий. Очі білі, очки, мальпігієві судини і сім’яники безбарвні (1). 

yellow, в. I, 00. Жовтий колір тіла; ротовий апарат личинки коричневий (1). 

vermilion, v, I, 33,0. Кіноварний колір очей, очки безбарвні (1).  

white apricot, w а, I, 1,5.  Абрикосові очі. Алеломорф white.

cut vermilion, ctv, I, 20,0-33,0. Обрізаний край крила, кіноварні очі. 

white cut, wct, I, 1,5-20,0. Білоокий, обрізаний край крила.

 scarlet spineless, stss, III, 44,0-58,5. Шарлаховий, багряно-червоний колір очей, бeзщетинковий.  

meller-5 (w ab), m-5, I, 1,5-57,0.  Смуговидні абрикосові очі. 

black cinnabar vestigial, bcnvg, II, 48,5-57,5-67,0. Чорний, кіноварноокий, зачатковокрилий.

Рис.22. Генетичні карти хромосом дрозофіли

Рис.23. Різні форми дрозофіл (нормальні та мутантні)

Хід роботи

1. Розгляньте зображення нормальних екземплярів дрозофіл (дика форма). Відмітьте й запишіть характерні ознаки: колір тіла, форму крил, колір очей.

2. Розгляньте зображення мутантних екземплярів дрозофіл (усіх наявних форм). Відмітьте й запишіть характерні ознаки: колір тіла, форму крил, колір очей.

3. Результати спостережень заносимо в таблицю:

Таблиця.

Порівняльна характеристика нормальних і мутантних форм мушки дрозофіли

№ п/п	Ознаки	Нормальна форма	Мутантна форма
1.	Забарвлення і розмір тіла
2.	Форма і розмір крил
3.	Забарвлення очей
4.	Інші ознаки

4. Зробіть висновок, у якому вкажіть особливості кожної з мутантних форм, за якими вона відрізняється від нормальних особин.

Контрольні питання.

1. Дайте визначення поняття мутація.

2. Які мутації називаються спонтанними?

3. Які мутації називаються індукованими?

4. Які мутації називаються точковими, або генними?

5. Назвіть основні фізичні мутагени.

6. Назвіть основні хімічні мутагени.

7. Чому виникають точкові, або генні мутації?

8. Яке практичне значення індукованого мутагенезу?

9. Назвіть мутації дрозофіли, що зв’язані зі змінами в будові і кольорі очей?

10. Назвіть мутації дрозофіли, які зв’язані зі змінами в кольорі тіла.

11. Назвіть мутації дрозофіли, які зв’язані зі змінами в формі і будові крил?

12. Як успадковується крилатість і зачаткові крила у дрозофіли?

13. Як успадковується білий колір очей у дрозофіли?

14. Як успадковується темний колір тіла у дрозофіли?

15. В яких хромосомах дрозофіли локалізовані гени крилатості, зачаткових крил?

16. В яких хромосомах дрозофіли локалізовані гени червоного і білого кольору очей?

17. В яких хромосомах дрозофіли локалізовані гени сірого і темного кольору тіла?

18. Які мутантні лінії дрозофіли, крім дикого типу, доцільно використовувати для схрещування при вивченні закономірностей успадкування однієї пари протилежних ознак?

19. Які мутантні лінії дрозофіли, крім дикого типу, доцільно використовувати для схрещування при вивченні закономірностей успадкування двох пар протилежних ознак?

20. Які мутантні лінії дрозофіли, крім дикого типу, доцільно використовувати для схрещування при вивченні закономірностей успадкування зчеплених зі статтю?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 10

Тема. Оцінка токсичності методом біотестування

Мета заняття: навчитись досліджувати як клітинні так і організменні реакції у відповідь на токсичну дію ксенобіотиків.

Матеріали і обладнання:  культура інфузорій Tetrahimena periformis, відстояна водопровідна вода (відібрана не менш, ніж за 24 год до проведення досліду, прокип’ячена протягом 1 год на водяній бані, закрита стерильним тампоном), використовувати верхній слой, мікроскоп, скляні палички, предметні і покривні скельця, паперові фільтри, 1% розчин ацетону, фарфорова ступка і товкач, пеніциловий флакон з корком, досліджувані продукти.

Теоретичні відомості.

Хімічні сполуки, що забруднюють навколишнє середовище і продукти харчування, здатні чинити на організм специфічну дію, що виявляється не в період дії і не відразу після закінчення, а у віддалені періоди життя індивідуумів.

Експерименти на теплокровних тварин з вивчення віддалених наслідків дії хімічних речовин тривають кілька років і вимагають великих витрат.

Як тест-об'єкта для виявлення токсичних речовин використовуються одноклітинні тварини – інфузорії Tetrahimena periformis.

На цих організмах розроблена прискорена методика визначення токсичних речовин.

Завдяки поєднанню в інфузорій ознак клітини і організму на них можна вивчати як клітинні так і організменні реакції на токсичний вплив.

Хід роботи

1. Взяти наважку досліджуваного продукту (5г), ретельно подрібнити, помістити в конічну колбу і долити 5 мл 1% розчину ацетону, струшувати протягом 15 хвилин з відкритим горлечком.

2. Після закінчення часу – фільтрують через складчастий фільтр.

3. У пеніциліновий флакон долити 3 мл заздалегідь кип'яченої води і 0,5 мл середовища з культурою Tetrahimena periformis. Використовувати даний флакон

як контрольний.

4. У другій флакон долити 3 мл отриманого фільтрату і 0,5 мл суспензії культури інфузорій (досліджуваний флакон).

5. На покривне скло нанести краплю з флакона з контролем і накрити покривним склом. Розглянути при малому збільшенні. Підрахувати кількість інфузорій у полі зору і розглянути їх морфофункціональний стан.

6. Так само вчинити з досліджуваним зразком.

7. Провести облік результатів, проробляючи пункт 4 і 5, через 15, 30 і 45 хвилин.

8. Облік результатів проводиться по морфофункіцональним змінам Tetrahimena periformis: деформація клітин, поведінка (рухливість), загибель клітин і лізис клітин.

9. Зробіть висновок за виконану роботу.

Контрольні питання.

1. Опишіть основні мехазми дії ксенобіотиків.

2. Назвіть фази детоксикації ксенобіотиків.

3. Що таке апоптоз?

4. Назвіть основні причини, обумовлені дією хімічних факторів на організм людини.

5. Що таке канцерогенез?

6. Опишіть фази метаболізму ксенобіотиків.

7. Охарактеризуйте хімічну класифікацію отруйних речовин.

8. Охарактеризуйте практичну класифікацію отруйних речовин.

9. Що таке некроз?

10. Охарактеризуйте гігієнічну класифікацію отруйних речовин.

11. Охарактеризуйте токсикологічну класифікацію отруйних речовин.

12. Від яких факторів залежить розподіл токсичних речовин в організмі? Дайте пояснення.

13. Опишіть як протікають фази виділення з організму отрут і їх метаболітів.

14. Що таке ксенобіотики?

15. Які речовини називають ессенціальними?

16. Опишіть шляхи детоксикації ксенобіотиків.

17. Назвіть основні характеристики більшості ксенобіотиків.