107-15

пептонного агара. Среды Гисса содержат какой-либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который изменяет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещён стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный субстрат с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырёк газа в поплавке. При сбраживании субстрата только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого - трёхсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расплавленном виде наливают в пробирку и дают застыть так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и затем уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в среде в большем количестве (лактозы, сахарозы), изменяется цвет всей среды, при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остаётся без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном и на некоторых полиуглеводных средах (например, на среде Клиглера). Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой (при взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца), или на средах, в состав которых входят соли железа или свинца, которые при взаимодействии с сероводородом дают чёрное окрашивание самой среды или выросших колоний (среды Вильсона-Блера, Клиглера и т.д.).

Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушенные, помещают между стенкой пробирки с питательным агаром и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя

31

часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный метод обнаружения индола позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) приводит к образованию красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещённой между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Желатиназа. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причём различные виды микробов дают характерную для них форму разжижения (послойно, в виде гвоздя, ёлочки и т.д.).

Другие протеолитические ферменты:

-при посеве на свёрнутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение);

-в молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Наличие уреазы у бактерий определяют на среде с мочевиной и индикатором фенол-рот (начальный цвет среды – жёлтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН

вщелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный.

Образования ацетоина (ацетил-метил-карбинола) при ферментации глюкозы проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола даёт красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетоин образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета – ацетилметилкарбинол.

Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии у бактерий фермента цитратпермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии продукции бактериями этого фермента среда остается зелёной.

Каталаза – это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспендируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде.

Обнаружение цитохромоксидазы у аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов проводится путём нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором

32

альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. При положительном результате бумажка синеет.

Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют йодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, даёт синее окрашивание среды.

Тест окисления/ферментации глюкозы (в аэробных/анаэробных условиях) устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержатся агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Посев осуществляют уколом в столбик питательной среды в две пробирки. Для создания анаэробных условий после посева среда в одной из пробирок заливается слоем стерильного вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зелёный цвет среды в жёлтый. При окислении глюкозы изменение цвета происходит в верхней части пробирки без вазелинового масла. При ферментации меняется цвет среды под слоем вазелинового масла (в анаэробных условиях). Тест используется для дифференциации аэробных бактерий от анаэробов и факультативных анаэробов. Аэробы (например, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, то есть только окисляют глюкозу, но не ферментируют её; анаэробы (например, Clostridium perfringens) утилизируют глюкозу только в анаэробных (т.е. ферментируют). Факультативные анаэробы (например, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) утилизируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Для экспресс-метода определения ферментативной активности микроорганизмов применяются микротест-системы и системы индикаторные бумажные (СИБ).

Диагностические микротест-системы (МТС) типа API-20-Е (для энтеробактерий), API-32-Gr+, ID32 GN, Enterotube и другие представляют собой полистироловые пластины с лунками, или планшеты, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды или только субстраты и индикаторы. Стерилизацию МТС проводят ультрафиолетовым облучением. Существует два основных типа таких систем. Это индивидуальные системы, рассчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся тестсистемы ПБДЭ, ПБДС (Россия), системы API (Франция) и многие другие. Второй тип систем основан на использовании многорядных планшетов, позволяющих одновременно проводить идентификацию нескольких культур. К системам этого типа относятся тест-системы фирмы Lachema (Чехия), ММТ Е (Россия), Enterotube II (США) и др. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определённой густоты. В контрольные ячейки наливают физиологический раствор. Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учёт результатов и их интерпретация осуществляются автоматически с помощью компьютера (Vitek, BioMerieux, Франция). Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате

33

визуально или при использовании автоматизированной компьютерной системы по изменению цвета индикатора. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой наборы бумажных дисков для выявления самых разнообразных ферментов бактерий. Диски пропитаны субстратом (углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами), а также содержат индикатор. Полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси вносят в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6) либо в 1% пептонную воду и помещают в эту пробирку соответствующий диск. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. После инкубации в термостате оценивают результаты тестов по изменению цвета среды и диска. Утилизация вещества приводит к изменению цвета индикатора. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный – через восемнадцать – двадцать четыре часа. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Виды ферментов: по их действию; по выделению в окружающую среду; конститутивные и адаптивные ферменты. Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения протеолитической и сахаролитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это значит? Среды Гисса, их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, как производится посев и как отмечают на этой среде ферментативные свойства бактерий? Методы определения протеолитической активности бактерий: разжижение желатина, образование индола, сероводорода, аммиака. Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности бактерий: как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ, как используется эта система, как производится посев и учёт результатов?

Задание на самостоятельную работу

Заполните таблицу в рабочей тетради: «Биохимические свойства бактерий».

Работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий - окончание (3 день). Посмотрите свои посевы предыдущего занятия, приготовьте мазки, окрасьте по Граму в

34

модификации Синёва, промикроскопируйте, сделайте вывод о чистоте выделенной культуры.

2.Изучение ферментативной активности бактерий. Посейте каждый вид выделенной чистой культуры на среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой и на среду Олькеницкого. Посев одной культуры производит группа из 4 человек.

3.Посмотрите микротест-системы, СИБ.

4.Учёт опыта по изучению действия физических и химических факторов на микроорганизмы. Заполните таблицу в рабочей тетради. Отметьте наличие роста знаком "+" и сделайте выводы.

5.Посев с кожи рук для изучения нормальной микрофлоры. Стерильный ватный тампон смочите в физиологическом растворе, протрите влажным тампоном кожу внутренней поверхности предплечья, затем произведите посев на чашку МПА.

Занятие 8 Распространение микробов в окружающей среде. Микрофлора почвы,

воды, воздуха. Санитарно-бактериологическое исследование воды, воздуха и почвы. Микрофлора организма человека и её функции.

Методы изучения. Дисбактериоз

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

-микрофлору почвы, воды и воздуха;

-методы санитарно-бактериологического исследования объектов внешней

среды;

-состав нормальной микрофлоры организма человека, причины его нарушения и способы восстановления.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо повторить:

-выделение чистой культуры аэробов и анаэробов;

-питательные среды;

-способы определения ферментативной активности микробов и учёта результатов.

Цель занятия

Изучить:

-методы и показатели, необходимые для микробиологической оценки объектов окружающей среды;

-состав нормальной микрофлоры организма человека и методы его

оценки;

-методы коррекции дисбактериоза.

35

План изучения темы

1.Экология микроорганизмов. Микрофлора почвы, воды, воздуха.

2.Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе.

3.Методы микробиологического исследования воды и воздуха.

4.Микрофлора организма здорового человека, значение её в физиологических условиях и в патологии.

5.Дисбактериоз. Биологические препараты для предупреждения и устранения дисбактериоза.

После изучения темы студент должен уметь

1.Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы по микробиологическим показателям.

2.Освоить основные микробиологические методы изучения микрофлоры организма человека.

3.Проводить оценку качественного и количественного состава микрофлоры кожи, ротовой полости.

Контрольные вопросы

Микрофлора воздуха: какие микробы чаще всего встречаются, как меняется микрофлора в зависимости от условий. Что такое микробное число воздуха, какими методами оно определяется? Что такое санитарнопоказательные микроорганизмы? Какие микробы считаются санитарнопоказательными для воздуха? Какие патогенные микробы могут передаваться через воздух? Микрофлора воды: происхождение, зависимость микрофлоры от условий. Что такое микробное число воды, как оно определяется? Санитарнопоказательные микробы для воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Возбудители каких заболеваний могут передаваться через воду? Микрофлора почвы, её значение в природе, зависимость от условий. Санитарно-показательные микроорганизмы. Какие патогенные микроорганизмы могут длительно сохраняться в почве?

Определите понятия: нормальная микрофлора организма человека; постоянная микрофлора; транзиторные микроорганизмы; потенциально опасные микроорганизмы. Назовите органы и ткани, свободные от постоянной микрофлоры. Какие микробы относятся к постоянной микрофлоре кожи и какое значение имеют транзиторные микробы? Характеристика микрофлоры различных областей организма: желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, мочеполовых органов, глаз, наружного уха. Как изменяется микрофлора ребёнка после рождения и в течение первого года жизни? Значение нормальной микрофлоры - положительное и отрицательное. Что такое дисбактериоз, в чём он выражается, причины его возникновения и способы предупреждения и устранения. Назовите препараты, применяемые для устранения дисбактериоза, что они содержат, как применяются, что с ними происходит в организме человека. Какие препараты рекомендуется применять для детей до 6-месячного возраста и для взрослых? Какие препараты применяются при нарушении анаэробной микрофлоры и аэробной? Какие препараты можно применять

36

одновременно с антибиотиками? Что такое бифидогенные препараты, приведите примеры.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Напишите названия препаратов, применяемых для устранения дисбактериоза, их состав, применение.

Работа студента на практическом занятии

1.Изучение ферментативной активности бактерий (окончание). Посмотрите посевы предыдущего занятия, отметьте и запишите результаты. На основании изучения морфологии, культуральных и биохимических свойств двух выделенных чистых культур сделайте вывод: название бактерий.

2.Посмотрите посевы с кожи рук. Приготовьте препараты - мазки из разных колоний, окрасьте по Граму в модификации Синёва, микроскопируйте, зарисуйте.

3.Приготовьте мазок из зубного налёта: на предметное стекло нанести бактериологической петлей каплю физиологического раствора. Стерильной заострённой деревянной палочкой возьмите у себя зубной налёт, внесите в каплю. Приготовленный мазок после высушивания и фиксации окрасьте по Граму в модификации Синёва, микроскопируйте, зарисуйте.

4.По результатам изучения нормальной микрофлоры сделайте выводы:

а) имеются ли в организме здорового человека различные виды микробов, в том числе сходные по морфологии с патогенными, и как их можно дифференцировать;

б) какое значение имеет наличие собственной микрофлоры аптечных работников при приготовлении лекарств и при проведении контроля лекарственных средств.

5. Изучите препараты, применяемые для предупреждения и устранения дисбактериоза.

Занятие 9 Санитарно-микробиологический контроль в фармацевтических

учреждениях. Микробиологический контроль лекарственного сырья и готовых лекарственных средств

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения материала необходимо знать:

-методы санитарно-бактериологического контроля в аптеке;

-принципы микробиологического исследования лекарственного сырья;

-принципы и технику определения антимикробной активности лекарственных средств, стерилизуемых и не стерилизуемых в процессе производства.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо повторить:

-выделение чистых культур бактерий аэробов и анаэробов;

-питательные среды.

37

Цель занятия

Изучить и освоить:

-методы и показатели, необходимые для микробиологической оценки объектов фармацевтических учреждений (воздух, дистиллированная вода, руки персонала, аптечная посуда);

-методы оценки микрофлоры лекарственного сырья;

-методы определения антимикробного действия лекарственных средств.

План изучения темы

1.Методы микробиологического исследования воды и воздуха.

2.Микробиологический контроль в аптеке.

3.Микрофлора лекарственного сырья и готовых лекарственных средств.

4.Микробиологические исследования лекарственных средств.

После изучения темы студент должен уметь

Проводить:

-санитарно-бактериологический контроль в аптеке;

-микробиологическое исследование микрофлоры лекарственного сырья;

-определение антимикробного действия лекарственного средства.

Дополнительный материал к занятию Методика микробиологического контроля в аптеках

Бактериологический контроль служит объективным методом проверки выполнения санитарных требований и правил личной гигиены аптечными работниками при изготовлении лекарственных средств.

Контроль производится в соответствии с нормативными документами, утверждёнными Министерством здравоохранения РФ.

Контроль осуществляется бактериологическими лабораториями учреждений Роспотребнадзора и лечебно-профилактических учреждений выборочно, по мере необходимости, но не реже 1 раза в квартал.

Объекты микробиологического контроля, отбор проб, методика исследования, оценка результатов

1. Дистиллированная вода, используемая для изготовления лекарственных средств (кроме лекарств для инъекций и глазных капель). Пробы отбирают в количестве 300 мл в стерильные бутылки с последующим закрытием ватными пробками и бумажными колпачками. Пробы отбирают из бюретки (или трубопровода), конец которой предварительно обжигают ватой, смоченной спиртом.

Определение количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий. Исследуемую воду вносят по 1 мл в две стерильные чашки Петри, затем заливают растопленным МПА. После застывания агара чашки выдерживают сутки при 37ºС и ещё сутки при комнатной температуре. После этого подсчитывают число выросших колоний как на поверхности, так и

38

внутри питательной среды. При вычислении результатов анализа выводят среднее арифметическое из числа колоний, выросших на обеих чашках.

Для выявления плесневых и дрожжевых грибов засевают по 0,5 мл исследуемой воды на 2 чашки со средой Сабуро и инкубируют при 20-22ºС в течение 3-4 суток. Затем подсчитывают число колоний плесневых и дрожжевых грибов на обеих чашках.

Результаты оценивают путём суммирования числа бактерий и грибов. Определение титра бактерий группы кишечной палочки (БГКП) проводится по методике для питьевой воды. Оценка результатов проводится в соответствии с требованиями ГОСТ «Вода питьевая».

2. Дистиллированная вода для приготовления инъекционных растворов и глазных капель. Инъекционные растворы до стерилизации. Глазные капли, приготовленные в асептических условиях на стерильных основах.

Пробы дистиллированной воды отбирают в стерильные флаконы в количестве 15-20 мл. Инъекционные растворы (до стерилизации) отбирают во время их приготовления, но не позднее 1,5 часов, и доставляют в лабораторию в тех же флаконах, в которых они будут подвергнуты стерилизации. Глазные капли доставляют в аптечной упаковке.

Определение количества мезофильных аэробов и факультативных анаэробов проводят так же, как в предыдущем исследовании.

Определение наличия БГКП в 1 мл проводится следующим образом. Исследуемый материал в количестве 1 мл засевают в 9 мл разведённой среды Эйкмана. Посевы выращивают при 37ºС в течение суток, затем высевают на среду Эндо и после суточного инкубирования чашек при 37ºС отбирают на чашках подозрительные колонии бактерий и определяют их принадлежность к БГКП.

Количественное определение БГКП проводится следующим образом. 1 мл исследуемого материала наливают в стерильную чашку Петри и заливают растопленной средой Эндо. После застывания среды её инкубируют при 37ºС в течение суток и учитывают количество типичных колоний.

Предельно допустимые количества микроорганизмов в 1 мл: дистиллированная вода, используемая сразу же после перегонки, не более 15, используемая после стерилизации для изготовления асептическим способом глазных капель - не более 3, растворы для инъекций до стерилизации не позднее 1,5 часов после изготовления – не более 30.

Наличие кишечной палочки, золотистого стафилококка, синегнойной палочки и протея в данной группе исследуемых материалов недопустимо.

3. Инъекционные растворы и глазные капли после стерилизации доставляются для исследования в аптечной упаковке. Материалы этой группы должны быть стерильными.

4. Отбор сухих лекарственных веществ производят по показаниям. Стерильными ложками в стерильную посуду лаборатории отбирают 30-50 г вещества. Если вещество таблетированное, отбирают фламбированным пинцетом в стерильную посуду лаборатории в таком же количестве.

39

5.Аптечную посуду, подготовленную для разлива инъекционных растворов и глазных капель, отбирают в момент приготовления их в количестве 3 штук одинаковой ёмкости. Флаконы доставляют в лабораторию в укупоренном виде, используя при этом аптечные пробки и прокладки.

Доставленные в лабораторию флаконы последовательно ополаскивают 10 мл стерильной водопроводной воды. Воду из флакона во флакон переливают над пламенем горелки, тщательно ополаскивая каждый флакон.

Пробки (корковые и полиэтиленовые) и прокладки отбирают в момент приготовления инъекционных растворов и глазных капель фламбированным пинцетом и помещают по 5 штук в широкогорлые стерильные колбы или банки

споследующим закрытием стерильными ватно-марлевыми пробками и бумажными колпачками. В лаборатории в колбы или банки наливают 10 мл стерильной водопроводной воды и тщательно ополаскивают.

Используемые в аптеках пипетки прополаскивают несколько раз в пробирке, содержащей 10 мл стерильной водопроводной воды, пробирки со смывной жидкостью доставляют в лабораторию.

Определение в смывной жидкости количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий проводится, как описано в пункте 1. Число колоний, установленное в 1 мл смывной жидкости, умножают на 10, что соответствует содержанию бактерий на всей смывной поверхности. Количество бактерий не должно превышать 150.

Определение наличия БГКП: 8 мл оставшейся смывной жидкости засевают в 1 мл концентрированной среды Эйкмана, инкубируют при 37ºС в течение суток и в дальнейшем идентифицируют БГКП. Наличие бактерий группы кишечной палочки не допускается.

6.Смывы с инвентаря, оборудования, рук персонала (во время приготовления лекарственных форм), санитарной одежды осуществляют с помощью ватных тампонов, помещённых в пробирки с физраствором. Влажным тампоном протирают исследуемую поверхность, затем тампон помещают в среду Кесслера или Кода. После инкубации в термостате пересевают на среду Эндо и определяют наличие БГКП.

Определение патогенных (золотистых) стафилококков осуществляют путём посева смыва в пробирку с солевым МПБ. После инкубации в термостате определяют наличие стафилококков.

Количественные определения их не проводятся. Наличие БГКП и стафилококков не допускается.

7.Исследование воздуха. Отбор проб воздуха производится при соблюдении следующих условий:

- чистое подготовленное к работе помещение; - закрытые форточки и двери;

- уровень высоты отбора воздуха соответствует высоте рабочего стола.

8.Методы микробиологического контроля лекарственных средств.

Присутствие микробов в лекарственных средствах нежелательно, за

исключением тех, в которых наличие микробов специально имеется в виду.

40