ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это лабораторный метод, используемый для амплификации последовательностей ДНК. В этом методе используются короткие последовательности ДНК, называемые праймерами, для выбора части генома для амплификации. Температура образца многократно повышается и понижается, чтобы фермент репликации ДНК дублировал копируемую последовательность ДНК. С помощью этого метода можно создать триллион копий исследуемой последовательности всего за несколько часов.
Амплификатор – прибор для проведения ПЦР. Суть его работы заключается в охлаждении и нагревании пробирок с пробами биоматериала. Точность результата зависит от точности температурного режима.
Процесс ПЦР обычно состоит из серии от 20 до 35 повторных изменений температуры, называемых циклами; Каждый цикл обычно состоит из 2-3 шагов при разных температурах. Обычная ПЦР выполняется с помощью циклов, состоящих из трех температурных ступеней. Шагам цикла часто предшествует тепловой удар (так называемое «удержание») при высокой температуре (> 90 ° C), за которым следует еще одно удержание в конце процесса для увеличения объема конечного продукта или кратковременного хранения. Используемые температуры и время, применяемое в каждом цикле, зависят от множества параметров. К ним относятся фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрация двухвалентных ионов и dNTP в реакции и температура связывания праймеров, а также длина ДНК, которая должна быть амплифицирована.
1. Денатурация
Сначала денатурируется ДНК и две нити, из которых она состоит, разделяются так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Этот этап может быть выполнен по-разному, наиболее распространенным способом является нагрев (94-95 ° C) образца. Температура, при которой решено провести денатурацию, зависит, например, от доли G + C в цепи, а также от ее длины. Другими методами, которые редко используются в методике ПЦР, может быть добавление солей или химических агентов, способных проводить денатурацию.
2. Отжиг
Затем произойдет гибридизация праймера, то есть праймер свяжется со своей комплементарной последовательностью на матричной ДНК. Для этого необходимо понизить температуру до 40-68 ° C на 20-40 секунд (в зависимости от случая), что позволит выполнить выравнивание. Полимераза связывает гибрид цепочки матрицы и праймера и начинает синтез ДНК. Праймеры будут действовать как границы для амплифицируемой области молекулы.
3. Элонгация
Полимераза действует, беря матричную ДНК для синтеза комплементарной цепи и начиная с праймера в качестве начальной поддержки, необходимой для синтеза новой ДНК. Полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи матрицы, путем добавления комплементарных dNTP в направлении 5 '→ 3', соединяя 5'-фосфатную группу dNTP с 3'-гидроксильной группой на конце растущей ДНК. Температура на этом этапе зависит от ДНК-полимеразы, которую мы используем. Для полимеразы Taq температура максимальной активности составляет 75-80 ° C (обычно 72 ° C). Время удлинения зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента ДНК. ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.