Саузерн блот

Саузерн-блот – это классический метод гибридизации; который назван по фамилии автора, предложившего его в 1975 г. Для анализа генов в данном методе необходимо определить локализацию сайтов рестрикции. То есть здесь эта информация используется для сравнения гомологичных генов разных видов, также для анализа организации интронов, и для выбора фрагмента, который подвергается клонированию. В данном методе расположение сайтов рестрикции в изучаемом гене можно определить без самого клонирования гена, используя молекулярные зонды (меченные радиоактивно или флуоресцентным красителем), которые комплементарны изучаемой последовательности.
Анализ метода состоит из последовательности следующих этапов:
1) выделение высокомолекулярной геномной ДНК из клетки;
2) ферментативное расщепление ДНК разными рестриктазами с образованием фрагментов разного размера;
3) разделение рестрикционных фрагментов в агарозном геле;
4) денатурация фрагментов ДНК щелочным раствором;
5) нейтрализация геля буферным раствором;
6) капиллярный перенос фрагментов на нейлоновый или нитроцеллюлезный фильтр
7) гибридизация с одноцепочечными радиоактивными зондами;
8) авторадиография для выявления гибридов: исследуемая ДНК / зонд.
В результате анализа полученного материала можно определить наличие или отсутствие некоторых сайтов рестрикции, характерные для изучаемого гена, которые ассоциируются с определенными мутациями. Здесь различные варианты расположения сайтов рестрикции в ДНК у двух разных людей называют Полиморфизмом Длины Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ). Этот полиморфизм используется как генетический маркер в изучении генотипа.
Данный метод имеет, однако, следующие недостатки:
• не позволяет выявить точечные мутации, не затрагивающие сайтов рестрикции (в пределах фрагмента рестрикции);
• является достаточно трудоемким, сложным и дорогим методом.

Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, который используется для определения в образце специфичных белков. Сам метод был разработан в лаборатории Джорджа Старка в Стэнфорде. Название «вестерн-блот» данной технике было дано У. Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от названия «Саузерн-блоттинг».
На первом этапе в данном методе используют электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку.
Преимущества метода:
Высокая специфичность к ВИЧ- редко дает ложноположительные результаты
Недостатки:
Долго ждать результат;
Должен проводиться опытным специалистом;
Дорогостоящий метод;
Возможны сомнительные результаты.