Оценка санитарного состояния почвы

микроорганизмы Bacillus anthracis, Clostridium spp. и др.; в) ограниченно сохраняющиеся – неспоровые бактерии Salmonella, Shigella, Vibrio,Brucella, Francisella, Mycobacterium, Leptospira, Pseudomonas

Поскольку заселение почвы болезнетворными микроорганизмами зачастую приводит к опаснейшим для человека последствиям, ее общероссийский санитарноэпидемиологический контроль является одной из важнейших государственных функций.

В ряде государственных природоохранных законов, других нормативных документах регламентированы требования к качеству почвы сельскохозяйственных угодий и населенных мест, показатели ее санитарно-эпидемиологической оценки, содержатся общие рекомендации по рациональному использованию и охране почвенного покрова.

Основные законодательные и нормативные документы, регулирующие санитарное состояние почвы.

Федеральный закон «Об охране окружающей среды» от 10 января 2002 г. (ст. 19). СанПиН 2.1.7.1287-03. Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы.

СП 1.2.1170-02. Гигиенические требования к безопасности агрохимикатов. – М.: Минздрав РФ, 2003. – 19 с.

СанПиН 1739-77. Оценочные показатели санитарного состояния почвы населенных мест. МУ 2.1.7.730-99 Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест.

ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа.

Методы микробиологического контроля почвы. Методические рекомендации № ФЦ/40222004.

МУ 1446-76 Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы (с Изменениями).

Таблица 2 ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ ПОЧВЫ

Для энтерококков (ЛПС - лактозо-пептонная среда, ЩЭС - щелочно-полимиксиновая среда).

Выделяют санитарно-микробиологические показатели и методы исследования почвы, использование которых позволяет дать комплексную санитарно-микробиологическую оценку почвенного покрова. Одни показатели (бактерии группы кишечных палочек, термофильные, нитрифицирующие, общее количество бактерий и Cl. perfringens) указывают на степень фекального загрязнения. Изучение состояния почвенного биоценоза по этим показателям и дополнительно по ряду групп и видов почвенной микрофлоры позволяет более глубоко определять изменения в почве, происходящие в результате бактериального, органического и химического загрязнений.

В соответствии с целями исследований в каждом конкретном случае можно использовать определенную группу показателей. При проведении текущего санитарного надзора за состоянием почвы целесообразно ограничить исследования проведением краткого санитарно-микробиологического анализа, указывающего на наличие и степень фекального

сравнительно высоких ее титрах титры Cl. perfringens и нитрифицирующих бактерий низкие. Это показывает, что в почве интенсивно протекают процессы самоочищения как от патогенных микроорганизмов, так и от органического загрязнения.

Высокий титр (1,0 и выше) кишечной палочки при низких титрах остальных 3-х показателей характеризует почву как свободную от возбудителей кишечных инфекций, но в которой еще не закончились процессы распада и минерализации органических веществ.

Высокие титры всех показателей свидетельствуют о законченных процессах самоочищения и характеризуют почву как чистую, свободную от патогенных энтеробактерий и органических загрязнений.

Эти моменты имеют важное значение при определении не только фактического санитарного состояния почвы определенных территорий, но и для выяснения стадий течения процесса самоочищения, установления сроков полива, удобрения почвы навозом и т.д.

О загрязнении почвы навозом и компостами свидетельствует повышенное содержание в ней термофилов (более 1000 клеток в 1 г почвы).

Дополнительным показателем является общее количество бактерий в грамме почвы. Единого норматива этого показателя нет, так как количество бактерий в почвах разных типов и климатических районов сильно варьирует. Для подзолистых почв наличие 10 млн. бактерий в грамме почвы и более указывает на фекальное загрязнение. Для других типов почв необходимо устанавливать конкретные нормативы этого показателя.

Косвенные микробиологические показатели не указывают на наличие или отсутствие в почве других возбудителей инфекционных заболеваний (столбняка, сибирской язвы, ботулизма), кишечника и других вирусов, патогенных для человека.

Необходимость в проведении анализов на тифопаратифозных и сальмонеллезных возбудителей возникает при расследовании вспышек, при установлении источника заражения, а также при проведении противоэпидемических мероприятий.

Таблица 3 СХЕМА ОЦЕНКИ САНИТАРНОГО СОСТОЯНИЯ ПОЧВЫ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

ОТБОР ПРОБ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ АНАЛИЗА. Санитарное обследование, выбор точек отбора проб.

Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов санитарного надзора с применением санитарно-микробиологических методов исследования и требующими проведения ряда мероприятий по предотвращению загрязнения почвы, являются: детские и лечебно-профилактические учреждения; сельские и неканализованные районы городских населенных пунктов; территории первого пояса зоны санитарной охраны источников хозяйственно-питьевого водоснабжения; зоны свалок, отвальных площадок;

сельскохозяйственные поля, орошаемые водой из открытых водоемов, стоками животноводческих ферм и комплексов и удобряемые навозом; земледельческие поля орошения городскими и промышленными сточными водами, а также при внесении их осадков в качестве удобрения.

На изучаемой территории при наличии одного источника загрязнения выделяют два участка, 25 кв. м каждый; один вблизи источника загрязнения (опытный), другой - вдали (контрольный). Контрольный выбирают с таким расчетом, чтобы он был заведомо незагрязненный и имел одинаковый почвенный состав с опытным.

Если на изучаемой территории имеется несколько источников загрязнения, то необходимо выделить несколько опытных участков около каждого загрязняющего внешнюю среду объекта. Если на территории нет видимых источников загрязнения, то необходимо выделить участки согласно элементам рельефа.

При санитарно-бактериологическом обследовании почвы значительных территорий определение количества точек для забора проб почвы производится согласно следующим рекомендациям. На каждые 100 га изучаемой территории при спокойном рельефе местности намечают к отбору проб почвы 6 - 7 участков площадью 25 кв. м

Отбор образцов почвы

Пробы почвы отбираются на каждом из участков в его пяти точках по диагонали или по "конверту" (четыре точки по углам и одна в центре).

В том случае, если исследователя интересуют последствия непосредственного внесения химического вещества в почву, пробы отбираются поверхностно (0-1 см) стерильным инструментом (нож, шпатель) в количестве 0,3-0,5 кг в одной точке.

Если изучается воздействие химического вещества на микрофлору почвенного горизонта, то для отбора проб почвы пользуются следующей методикой. Каждая точка, в которой проводится отбор проб почвы, представляет собой центр выбранного для исследования 1 мМУ 1446-76 Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы (с Изменениями) территории. Здесь выкапывается прикопка (шурф) размером в плане 0,3 мМУ 1446-76 Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы (с Изменениями)0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской. Так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 смМУ 1446-76 Методические указания по санитарномикробиологическому исследованию почвы (с Изменениями)3 смМУ 1446-76 Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы (с Изменениями)3 см, 500 г - 20 смМУ 1446-76 Методические указания по санитарномикробиологическому исследованию почвы (с Изменениями)5 смМУ 1446-76 Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы (с Изменениями) 3 см.

Таблица 4 Методические принципы отбора почвы санитарного состояния почв

При изучении воздействия пестицидов и др. химических веществ на микрофлору и процессы самоочищения в более глубоких слоях почвы для отбора проб почвы пользуются шурфом глубиной до 1 м. Пробы отбираются из стенки шурфа стерильным инструментом через каждые 10 см.

В тех случаях, когда исследователя интересует влияние химических веществ на микрофлору почвы и процессы самоочищения в более глубоких слоях почвы, не имеет большого смысла отбирать пробы почвы, а следует производить изучение грунтовых вод, отбираемых с помощью прибора Гончарука.

Отобранные образцы помещают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию. При невозможности приступить к исследованию почвы немедленно допускается хранение образца при температуре 4-5°, но не более 24 часов.

Подготовка и обработка почвы для анализа

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Если проба почвы однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы.

Перед посевом почву диспергируют. С этой целью почву с соблюдением условий стерильности просевают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито покрывают сверху стерильной бумагой. Почву дисперсную можно не подвергать просеиванию. Почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке. Неперегнившую растительную массу отбрасывают. Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов и энтеровирусов достаточно навески от 1 до 10 г, для санитарно-показательных микроорганизмов от 1 до 30 г, для патогенных энтеробактерий (50-55,5 г). Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя стерильную водопроводную воду в соотношении 1:10 к весу почвы (например: 1 г почвы разводят в 10 мл стерильной водопроводной воды, 10 г почвы - в 100 мл воды и т.д.). После приготовления навески применяют соответствующую предварительную обработку почвы в зависимости от типа и вида учитываемого

микроорганизма. Основная цель, которую преследуют проводя предварительную обработку почвы, заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц. Основными приемами предварительной обработки почвы являются: 1) 10-минутное вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками - при навеске почвы 1 г; 2) 3-минутная обработка почвенной суспензии первого разведения на мешалке механического диспергатора (размельчитель тканей, марки РТ-2) - при навеске почвы более 1 г. Почвенную суспензию, содержащую в 1 мл 0,1 г почвы, через 30 секунд после предварительной обработки (за это время оседают грубые минеральные частицы) используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Для этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 г/мл отбирают стерильной пипеткой 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 г/мл почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001-0,00001 г/мл. Для приготовления каждого разведения используют отдельные пипетки. Приготовленные децимальные разведения используются для посева почвы на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.

Для определения отдельных показателей применяются и другие способы обработки, описание которых приводится ниже в соответствующих разделах. Для получения сравнимых и более полных результатов желательно производить пересчет количества обнаруживаемых микроорганизмов на 1 г абсолютно сухой почвы. Для этого необходимо производить определение влажности анализируемого образца почвы. С этой целью навеску почвы (10-20 г) помещают в заранее взвешенный стеклянный или металлический бюкс и высушивают в сушильном шкафу при 105°С. Первое контрольное взвешивание высушенной почвы делают через 3 часа, затем высушивают почву до постоянного веса (контрольное взвешивание каждые 2 часа). Расчет производится по следующей формуле:

N - количество клеток бактерий в 1 г абсолютно сухой почвы; Nc - количество клеток бактерий в г сырой почвы;

а - степень десятикратного разведения;

n - число колоний, выросших на чашке (берется среднее арифметическое из всех чашек); С - влажность исследуемой почвы (%).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ ФЕКАЛЬНОЕ ЗАГРЯЗНЕНИЕ ПОЧВЫ.

Определение количества бактерий группы кишечных палочек К бактериям группы кишечных палочек (БГКП) относятся грамотрицательные, не

образующие спор короткие палочки, сбраживающие лактозу и глюкозу с образованием кислоты и газа при 37+/-0,5° в течение 24-48 часов, не обладающие оксидазной активностью.

В настоящее время имеется возможность дифференцированно подходить к выбору методики определения БГКП в почве. При анализах почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение БГКП титрационным методом. При этом возможно использование любой из двух равнозначных по эффективности сред - Кесслера-Свенертона или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранных фильтров. При

анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведений почвенной суспензии на среду Эндо. Заключительный этап исследования заключается в идентификации выросших на агаризованных средах характерных колоний, которая производится аналогично анализу кишечных палочек в воде. Из типичных колоний приготовляют мазки и окрашивают их по Граму.

У грамотрицательных палочек проверяют оксидазную активность. Постановка оксидазного теста при этом осуществляется следующим образом: петлей или стеклянной палочкой снимают колонии грамотрицательных палочек со среды Эндо и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (30 - 40 мг альфа-нафтола растворяют в 2,5 мл ректификованного этилового спирта, прибавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40 - 60 мг диметилфенилендиамина.). В месте нанесения бактериальной массы цвет бумаги не изменяется, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин,

если бактерии имеют активную оксидазу. Исследование изолированных колоний является обязательным, иначе можно необоснованно отбросить кишечную палочку при ложном посинении за счет примеси оксидазоположительных бактерий. Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко из-за того, что мешают ингибиторы, то для получения правильного результата такие колонии можно пересеять на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест.

При наличии на поверхности агаризованной среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2-3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4-5 и 18 часов инкубации при 37°С. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы.

Рис. Определение бактерий группы кишечной палочки в почве

Коли-индекс — количество кишечных палочек, обнаруживаемое на 1 л жидкости, 1 кг твердого вещества (для пищевых продуктов) и в 1 г почвы. Мембранный метод. Коли-титр — наименьшее количество жидкости или твердого вещества (выраженное соответственно в миллилитрах или граммах), в котором обнаруживаются кишечные палочки. Титрационный метод.

Для перевода титра в индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр и наоборот. Коли-индекс равен 40, коли-титр равен 25 (1000 : 40).

Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного

фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 мл на поверхность среды Эндо обычным способом. Среда Эндо заранее разливается в чашке Петри и подсушивается в сушильном

шкафу при температуре 50-60°С до образования так называемой "муаровой" пленки. Возможно подсушивание чашек Петри со средой Эндо путем постепенного высушивания их при комнатной температуре. В этом случае чашки со средой Эндо оставляют на сутки на рабочем столе в положении "крышкой вниз", прикрыв их от света. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведений от 1:10 до 1:1000. При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 1:1000000. Посевы выращивают в термостате при 37° в течение 24 час. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению кишечных палочек титрационным методом.

Результаты анализа последними двумя методами можно выразить в коли-титре или колииндексе. В любом случае расчет ведется с учетом влажности анализируемой почвы. Чтобы подсчитать число клеток кишечной палочки в 1 г сырой почвы, необходимо среднее число колоний на чашке умножить на степень разведения, затем проводят перерасчет на 1 г абсолютно сухой почвы, согласно ранее приведенной формуле.

Определение в почве общего количества бактерий Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения

используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, растущих на мясо-пептонном агаре при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясо-пептонный агар (возможно использование питательного агара дагестанского производства). Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение тщательно перемешивают стерильной пипеткой, после чего берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45° питательный агар в количестве 15-20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией, осторожно наклоняя чашки во все стороны. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды. На чашке должна быть сделана надпись с указанием номера или названия пробы и разведения.

После застывания агара чашки с посевом помещают в термостат в перевернутом виде (крышкой вниз) при температуре 37° на 24 часа.

После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчет на 1 г абсолютно сухой почвы.

Определение термофильных бактерий При выявлении степени фекального загрязнения почвы целесообразно провести

определение в ней количества термофильных микроорганизмов. Как известно, последние не свойственны незагрязненным почвам. В почву термофилы попадают вместе с органическими удобрениями (навоз, компосты, термы). Сточные жидкости, фекалии и свежий навоз богаты кишечной палочкой, но бедны термофилами. Поэтому если почва содержит много кишечных палочек и много термофилов, то очевидно она была удобрена навозом и компостами. Почвы, показывающие высокое содержание кишечных палочек и бедные термофилами, можно рассматривать фекально загрязненными.

Учет термофильных сапрофитных микроорганизмов производят на мясо-пептонном агаре, который следует разливать более толстым слоем, чем обычно. Посев производят из разведений 1:10 - 1:1000000 на 2 - 3 параллельные чашки Петри. Термофильные бактерии выращивают при 60 +/- 2 °C. Учет производят через 24 часа инкубации аналогично, как и при определении общего количества бактерий в грамме почвы.