LEKTsIYa_gGENETIKAlekts_Genetika_miroorganizmov

Дифференциирующие признаки S- и R- форм N.meningitidis

Использование молекулярно-генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний

Плазмидный анализ

Гибридизация ДНК (Э.Болтрон, Б.Хойер, Маккарти, 1964 г.)

Полимеразная реакция амплификации – ПЦР (Кей Мюллис, 1984 г. В 1993 году присуждена Нобелевская премия)

Рестрикционный анализ хромосомной ДНК

Риботипирование

Секвенирование (анализ нуклеотидной последовательности)

Молекулярная гибридизация

молекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР)

экспериментальный метод, позволяющий добиться многократного копирования (амплификации)

определённого фрагмента ДНК in vitro.

Специфичность ПЦР основана на образовании

комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими

олигонуклеотидами длиной 18 – 30 нуклеотидов.

Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с

одной из цепей двуцепочечной матрицы, ограничивая

амплифицируемый участок с двух сторпон.

ПЦР осуществляется в присутствии ДНК-

полимеразы.

Для проведения ПЦР необходимы:

2-а типа праймеров

Дезоксинуклеотиды-трифосфаты 4-х типов

ДНК-полимераза (из термофильных бактерий)

Реакция осуществляется в термоциклере.

Этапы и режимы ПЦР:

1 этап- «плавление ДНК» (1 мин, 94 градуса С)

2 этап – «отжиг» (1-1,5 мин, 45-65 градусов С)

3 этап элонгация – достраивание комплементарной цепи (72 градуса С)

Каждая из синтезированных копий в последующих циклах служит матрицей, таким образом реакция идет экспотенциально.

Область применения в микробиологии

Прямая диагностика и идентификация возбудителей

инфекционных заболеваний

Определение генотипических маркеров

резистентности у микроорганизмов

Молекулярное типирование микроорганизмов

Помимо амплификации (увеличения числа копий)

ДНК, ПЦР позволяет производить множество

других манипуляций с нуклеиновыми кислотами

(введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и

широко используется в биологической и

медицинской практике, например, для диагностики

заболеваний (наследственных), для установления

отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Преимущества ПЦР:

Скорость и высокая производительность

Высокая специфичность

Высокая чувствительность