РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

1. Происхождение и эволюция эукариотического генома. Гены-гомологи, ортологи и паралоги. Взаимосвязь сложности генома и его размера.

Внутриклеточные эндосимбионты, которые первоначально произошли от свободноживущих прокариот, сыграли важную роль в эукариотической эволюции, породив два цитоплазматических органоида. Митохондрии развились из α- протеобактерий, а хлоропласты — из цианобактерий. Оба органоида внесли весомый вклад в совокупный генόм эукариотических ядер. Включения митохондрий и хлоропластов в эукариотическую линию посредством эндосимбиоза и дальнейшей параллельной эволюции ядерного и органоидных геномов.

Несмотря на множество сообщений о горизонтальном переносе генов из прокариот в эукариоты и между эукариотами, комплексные исследования всех деревьев не выявили никаких доказательств кумулятивного эффекта непрерывного ГПГ на эволюцию эукариотических геномов.

Это указывает на одну из следующих возможностей:

•перенесенные горизонтально гены, специфичные для определенных линий, быстро элиминируются;

•восприимчивые к ГПГ линии не дают начало эволюционно стабильным потомкам (тупиковы);

•многие предполагаемые продукты ГПГ на самом деле не являются линияспецифичными, и при расширении аналитической выборки эукариот они будут обнаружены у других отдаленных родственников, что докажет причинную роль дифференциальной потери в возникновении неоднородности распределения генов;

•возможна любая комбинация описанных вариантов.

Эволюция эукариот связана с нарастающим увеличением количества ДНК. На фоне такого увеличения большая часть ДНК является «молчащей», т.е. не кодирует аминокислот в белках или последовательностей нуклеотидов в рРНК и тРНК.

Увеличение ДНК осуществляется различными способами:

•Наиболее резко размер генома изменяется в результате полиплоидизации, которая достаточно широко распространена в природе - увеличение количества ДНК и хромосом, кратном гаплоидному.

•Хромосомные перестройки, сопровождающиеся изменением содержания ДНК в них, такие, как дупликации, делеции и транслокации. Они обусловливают повторение, утрату некоторых последовательностей в составе хромосомы или перенос их в другие хромосомы.

•Амплификация нуклеотидных последовательностей -образование их копий, что приводит к возникновени повторяющихся участков ДНК. Особенностью генома

эукариот является наличие таких повторов в большом количестве, свидетельствующее о существенном вкладе механизма амплификации в увеличение размеров наследственного материала.

Конкретные изменения, приводящие к амплификации, бывают различными. Появление тандемов повторяющихся последовательностей объясняется, например, неравным кроссинговером, вследствие которого возникают многократные дупликации отдельных участков ДНК. Возможна амплификация путем вырезания фрагмента с последующей его репликацией вне хромосомы и встраиванием копий в другие хромосомы. Предполагают также амплификацию, осуществляемую путем «обратной транскрипции» ДНК на РНК с участием фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием копий ДНК в различные локусы хромосом.

Дивергенция амплифицированных последовательностей с образованием разных генов или их семейств обусловлена накоплением в них различных изменений в виде замен оснований или других генных мутаций.

Транспозоны: определенная роль в эволюции принадлежит подвижным генетическим элементам — транспозонам. Они представляют собой автономные единицы, несущие в нуклеотидной последовательности информацию о структуре особых белков, которые обеспечивают их способность к перемещению из одного участка генома в другой.

Размер генома - это общее количество ДНК, содержащееся в одной копии одного полного генома.

Размеры геномов разных видов значительно отличаются друг от друга даже в пределах рода, животные до 3300 раз, растения до 1000. При этом часто не наблюдается корреляции между уровнем эволюционной сложности вида и размером его генома.

Гомологичные гены - гены, имеющие сходную первичную структуру (последовательность нуклеотидов), общее происхождение и контролирующие один и тот же признак. Гомологичные гены могут возникать в геноме в результате удвоения (дупликации) одного гена (такие гомологичные гены называют паралогами или присутствовать у разных организмов сохранившимися от общего предка (такие гомологичные гены называют ортологами).

Паралоги - возникают в результате дупликации гена и могут разойтись в процессе эволюции настолько, что начнут выполнять разные функции. Возникают путем внутригеномных дупликаций и могут эволюционировать с приобретением новых функций. Паралогичные гены обеспечивают видам адаптацию к меняющимся условиям окружающей среды.

Ортологи - это гомологичные белки из разных организмов, разошедшиеся в процессе видообразования и выполняющие одну и ту же функцию (чаще всего). Кодируют

строение ключевых макромолекул клетки, участвующих в процессах репликации, транскрипции, трансляции и репарации генетического материала. Мутации ортологов, как правило, летальны. Типичный пример ортологичных генов - гистоновые гены, кодирующие белки гистоны (HI, H2A, Н2В и НЗ), участвующие в образовании нуклеосом при первом уровне компактизации ДНК в составе хромосом.

Ксенологи. Гены, попавшие в организм при горизонтальном переносе из другого организма, называются ксенолагами.

2. Перспективы молекулярной диагностики заболеваний на основе исследований протеома.

Протеомная карта какой либо ткани/клетки – количественный и качественный набор белков ткани/клетки, отображает какие белки и сколько их есть в исследуемом образце. Если получить протеомные карты нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики.

Что можно получить:

•дешевые и доступные каждому методы медицинской диагностики, которые позволяют определять самые ранние стадии развития заболеваний.

•индивидуальные методы лечения заболеваний, которые в настоящее время считаются неизлечимыми.

•создание новых методов биоинформатики и новых технологий, позволяющим исследователям работать в низких концентрациях.

Молекулярная (протеомная) диагностика является достоверным инструментом диагностики ранних стадий онкологических заболеваний и конкретно диагностики "молчащих раков", не проявляющих себя до тех пор, пока лечить его не станет поздно. Традиционные методики верификации рака подразумевают проведение биопсии, то есть забора микропорции ткани. Альтернатива – протеомная диагностика.

Медицинский аспект проблемы - установить корреляцию между набором белков и началом или развитием болезни. Задача сходна с геномикой, где определяется зависимость между болезнью и геномом, но на порядок сложнее, т.к. белков гораздо больше, чем генов. ДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР, белки – нет. Следовательно, методической основой протеомики является подход, при котором чувствительность приборов позволяет регистрировать отдельные молекулы.

Проект "Протеом человека" – планирует конструирование протеомной карты всех белков человека. Первоочередные задачи проекта "Протеом человека" - составление протеомных карт плазмы крови, печени и мозга.

Схема проведения протеомного анализа: основана на масс-спектрометрии.

3.Разделение образца (например плазма крови) методом двумерного электрофореза, и на двумерной электрофоре-грамме каждый белок предстает в виде отдельного пятна. Его интенсивность соответствует уровню экспрессии белка, то есть его количеству. Анализ гелей позволяет выявить индивидуальные вариации протеома, оценить статистические параметры для каждого пятна.

4.Затем, сравнивая электрофореграмму с эталонными, удается выявить различия, связанные с заболеваниями. Различия заключаются в повышении или понижении экспрессии белка, некоторые белки появляются в плазме больных, тогда как другие могут исчезнуть. Однако на этапе анализа двумерных электрофореграмм речь на самом деле еще не идет о конкретных белках, а только об интенсивности пятен. Для того чтобы определить (идентифицировать) белок, пятно вырезают из геля, подвергают расщеплению, и массы фрагментов (пептидов) детектируют с помощью масс-спектрометрии.

Билет 25.

1.Метагеном. Метагеномика окружающей среды и организма человека. Анализ метагеномов и его применение.

Метагеном - совокупный геном сообщества организмов, например: - Человек со своим микробным сообществом - Капелька океанской воды с сообществом микроорганизмов - Образец почвы

•Анализ метагенома позволяет - определить видовое разнообразие исследуемого образца без культивирования и выделения отдельных организмов –

•выяснить механизмы функционирования сообществ, определить метаболические взаимосвязи

Основным преимуществом использования метагеномного подхода является учёт не только культивируемых микроорганизмов, но и некультивируемых. Оказалось, что такие организмы вносят основной вклад в видовое разнообразие сообществ.

Основное видовое богатство Земли (разнообразие видов) – микроорганизмы. Почва содержит наибольшего кол-ва видов (осн: археи, бактерии, грибы, простейшие, нематоды, микроартроподы, водоросли, вирусы) Идентификация – по генам 16S и 18S рРНК, напр., для бактерий число отделов выросло в 3 раза до ~40 за посл 10 лет

АНАЛИЗ МЕТАГЕНОМА

•тотальное секвенирование (shotgun) Широкое развитие метагеномики обусловлено распространением методов секвенирования нового поколения. Они позволяют получить последовательности практически всех генов каждого микроорганизма сообщества.

•Задача определения видового состава сообщества решается с помощью секвенирования определенных генов, которые должны быть у всех организмов в сообществе. Некоторые участки таких последовательностей геномной ДНК, как например ген, кодирующий 16S рРНК, состоят из высококонсервативных последовательностей и гипервариабельных участков. Эта особенность позволяет использовать праймеры для секвенирования, которые комплементарны консервативным участкам для получения последовательностей гипервариабельных участков. Полученные последовательности позволяют отнести организм к тому или иному виду.

Преимущества классификации по 16S rRNA — один из трёх основных типов рРНК, образующих основу рибосом прокариот. :

• Много копий генов

•Имеет консервативные и гипервариабельные районы

•Огромная база данных

Метагеномика окружающей среды ― это изучение микроорганизмов на основе анализа ДНК в образцах окружающей среды.

Данные исследования метагеномики окружающей среды используются для анализа сельскохозяйственных микробиомов, восстановления окружающей среды или других биологических исследований.

Анализ микробиома человека ― это изучение микробных сообществ, обнаруженных в организме человека и на нём. Целью исследований микробиома человека является понимание роли микробов в его здоровье и заболеваниях.

Применение метагеномики

Улучшение окружающей среды Повышение плодородия почвы Идентификацию новых биокатализат-ов (ферменты, увеличивающие скорость хим реакций) Открытие новых антибиотиков Персонализированная медицина Биоремедиация (представляет собой набор биотехнологий санитарии окружающей среды, которые используют метаболические возможности бактериальных микроорганизмов, грибов, растений и / или их выделенных ферментов, для устранения загрязнений в почве и воде)

2.Транскриптом и виды РНК в клетке. Функциональное значение различных клеточных РНК.

Транскриптом — совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК. Понятие «транскриптом» может обозначать полный набор транскриптов в данном организме или специфический набор транскриптов (молекул РНК), представленный в клетках определённого типа.

В отличие от генома, который, как правило, одинаков для всех клеток одной линии, транскриптом может сильно меняться в зависимости от условий окружающей среды.

РНК – полимерные молекулы, в состав которых входят рибонуклеозиды уридин, аденозин, гуанозин и цитидин, соединенные 3'- 5'-фосфодиэфирными связями. В отличие от ДНК, эти молекулы находятся не только в клеточном ядре эукариот, но и в других. Молекулярная масса РНК существенно меньше, чем ДНК. Это одноцепочечные молекулы, но в их структуре часто имеются двухцепочечные участки (дуплексы), образующие «шпильки» благодаря водородным связям между комплементарными основаниями.

Молекулы РНК: можно разделить на 2 класса – кодирующая белки матричная

(мРНК) и разнообразные не кодирующие белки РНК, среди которых РНК

транспортная (тРНК) и рибосомальная (рРНК) так или иначе «обслуживают» процесс синтеза белка, а также митохондриальная и пластидная РНК (эта органелла имеет собственный генетический и белковосинтетический аппарат) и различные малые РНК.

Матричная РНК. Синтезируется в ядре клетки, и ее уникальная первичная последовательность является шаблоном (матрицей) для синтеза белка, закодированного в гене (соответствующем фрагменте ДНК).

Первичная структура всех мРНК имеет схожее строение З'- и 5'-концов.

Уэукариот На 3'-конце большинства мРНК присутствует последовательность нуклеотидов из 100-200 аденозинфосфатных остатков – поли(А)- 86 фрагмент. Эту последовательность используют при выделении мРНК с помощью аффинной хроматографии на колонке, заполненной сорбентом с политимидиновыми (поли-Т) олигонуклеотидами, иммобилизованными на поверхности.

Уэукариот на 5'-конце всех мРНК присутствует модифицированный нуклеотид 7- метилгуанозин-5'-трифосфат (кэп). Через несколько десятков нуклеотидов от кэпа находится инициирующий кодон – триплет AUG, кодирующий аминокислоту метионин. За кодирующим («смысловым») участком обязательно следует один из терминирующих (стоп) кодонов UGA, UUA или UAG.

Транспортные РНК. Выполняют функцию доставки аминокислоты к рибосоме при синтезе белка. Структура тРНК, независимо от различий в последовательности нуклеотидов, описывается универсальной моделью "клеверного листа". На 3’- конце молекулы находится участок с последовательностью С-С-А связывания аминокислоты, а на противоположном конце – участок, называемый антикодон – триплет комплементарный кодону матричной РНК. Каждой аминокислоте для переноса соответствует определенная одна или несколько тРНК с соответствующим триплетом – антикодоном.

В состав нуклеотидов тРНК входят так называемые минорные основания (в среднем 10-12 на молекулу). Они представлены метилированными основаниями, изомерами и аналогами пиримидинов. Эти основания делают молекулу устойчивой к расщеплению нуклеазами, а также обеспечивают определенную пространственную структуру молекулы, т.к. не образуют комплементарных пар, препятствуя спирализации молекулы в определенных участках.

Рибосомальные РНК. Находятся в рибосомах и составляют от их массы до 60%, остальную массу составляют рибосомальные белки.

Рибосомы – это внутриклеточные органеллы, которые обеспечивают синтез полипептидной цепи в соответствии с «текстом», заданным нуклеотидной

последовательностью матричной РНК – процесс, называемый трансляцией. Рибосомальные РНК обладают разной молекулярной массой и имеют многочисленные сдвоенные спирализованные участки. В составе рРНК встречаются как минорные основания, так и производные рибозы (например, 2'-метилрибоза).

Малые интерференционные РНК и другие виды короткоцепочечных РНК.

Исследования последних десяти лет указывают на их ключевую роль как регуляторов процессов репликации ДНК, а также транскрипции и трансляции. Это класс двухцепочечных РНК, длиной 20-25 нуклеотидов. Взаимодействие малых интерферирующих РНК с матричной РНК (мРНК) целевого гена приводит к деградации последней (в процессе РНК-интерференции), предотвращая трансляцию мРНК на рибосомах в кодируемый ею белок. В конечном итоге результат действия малых интерферирующих РНК идентичен тому, как если бы просто снижалась экспрессия гена. Могут просто садиться на последовательность мРНК, быть ей комплементарной и приволить в негодность, либо в 3’ нетранслируемую область присоединяться и блокировать трансляцию.

Малые ядерные РНК — класс РНК, которые встречаются в ядре эукариотических клеток. Участвуют в важных процессах, таких как сплайсинг (удаление интронов из незрелой мРНК), регуляции факторов транскрипции или РНК-полимеразы и поддержании целостности теломер.

МикроРНК. Представляют собой некодирующие РНК длиной 21—22 нуклеотида, принимающие участие в регуляции экспрессии генов. МикроРНК связываются со специфическими последовательностями мРНК в 3'-нетранслируемой области и вызывают ингибирование трансляции либо удаление поли(А)-хвоста.

Билет 26.

1.Уровни регуляции экспрессии генов в клетке. Координация экспрессии различных групп генов.

Экспрессия генов — процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Большая часть генома находится в клетках организма в неактивном состоянии. Спектр функционирующих генов зависит от тканевой принадлежности клетки, от периода ее жизненного цикла и стадии индивидуального развития организма.

Регуляция экспрессии (выражения) генов может осуществляться на нескольких уровнях:

•Генном – связан с изменением количества или локализации генов, контролирующих данный признак

•Транскрипционном – определяет, какие и сколько и РНК должны синтезироваться в данный момент (альтернативный сплайсинг, экзон-интронная стру-ра)

•Трансляционном – обеспечивает отбор иРНК, транслирующихся на рибосомах

•Функциональном – связан c аллостерической регуляцией активности ферментов

•Посттрансляционные модификации полипептидов, иРНК и др.

Основные отличия экспрессии генов прокариот от эукариот:

•Почти всегда оперон эукариот содержит только один структурный ген в то время как у вирусов и прокариот в большинстве оперонов их бывает несколько, иногда более десятка.

•У эукариот структурные гены, ответственные за разные звенья той или иной цепи биохимических реакций, как правило, разбросаны по геному, а не сосредоточены в одном опероне, как это часто имеет место у прокариотов.

•У эукариот существует одновременное групповое подавление активности генов во всем ядре, в целой хромосоме, или в большом ее участке. Такая групповая репрессия генов осуществляется в значительной мере гистонами-белками, входящими в состав эукариотических хромосом.

•Существует система регуляции с помощью стероидных гормонов. Последние связываются со специальными белками-рецепторами, расположенными в мембранах клеток-мишеней. Синтез белков-рецепторов контролируется геном тестикулярной феминизации Х-хромосомы. Такой комплекс обеспечивает активацию определенного гена.

•Транскрипция и трансляция у эукариот разобщены (у прокариот — сопряжены). Синтез и-РНК происходит в ядре, а белков — на рибосоме.

Регуляция экспрессии генов у бактерий – оперон. На стадии транскрипции принимают негенетические факторы – эффекторы – вещества небелковой природы, взаимодействующие с белками-регуляторами и изменяющие их способность соединяться с нуклеотидными последовательностями операторов. Индукторы – запускающие транскрипцию, и корепрессоры – препятствующие транскрипции.

В эукариотических клетках превалируют положительные регуляторные механизмы над отрицательными.

ТАТА-бокс — консервативный мотив ДНК эукариот, который располагается в промоторной области генов у архей и эукариот примерно на 30 нуклеотидов выше сайта начала транскрипции. С ним связываются транскрипционные факторы, привлекающие РНК-полимеразу к сайту начала транскрипции (ТАТА-фактор).

Энхансеры и сайленсеры – распологаеются не рядом с транскрибируемым участком, но регулируют транскрипцию. С ними связываются белки-репрессоры или индукторы.

Гормональная регуляция транскрипции. Так, некоторые стероидные гормоны обратимо связываются особыми белками-рецепторами, образуя с ними комплексы. Активированный гормон рецептор приобретает способность соединяться со специфическими участками хроматина, ответственных за регуляцию активности генов, в которых рецепторы узнают определенные последовательности ДНК.

Пример: участия гормонов в регуляции активности определенных генов может служить влияние тестостерона на развитие тканей организма по мужскому типу при

наличии специфического белка-рецептора. Отсутствие последнего при мутации соответствующего гена не дает возможности гормону проникнуть в ядра клетокмишеней и обеспечить включение определенного набора генов.

Пост-трансляционные изменения. Пример: для формирования активной формы белкового гормона — из проинсулина должны удаляться две субъединицы. Торможение этих процессов уменьшает выход конечного активного продукта.

Инсуляторы – регуляторные посл-ти ДНК, обладают способностью защищать гены от сигналов, приходящих от соседней ДНК. Размер: типично 300-2000 bp

Функции:

• Блокировка энхансер, предотвращают действие дистальных энхансеров на промотор соседних генов.

Барьерные инсуляторы предотвращают инактивацию эухроматина за счет распространения соседнего гетерохроматина.

РНК интерференция – инактивация гена путем деградации мРНК.

2. Структурная организация белковых молекул: первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры.

Первичная структура – аминокислотная последовательность белка. Пептидные связи, возникающие в результате взаимодействии a-карбоксильных и a-аминогрупп аминокислот.

Свойства первичной структуры: 1) Последовательность аминокислот в первичной структуре белка является специфической видовой характеристикой данного белка. 2) Первичная структура белка является основой для формирования последующих структур белка за счёт взаимодействия радикалов аминокислотных остатков полипептидной цепи.

Вторичная структура – единица пространственной организации полипептидов. Происходит взаимодействие пептидных групп с образованием между ними