bio_5денисенко

Вариант № 5

Вопрос № 1

Микробиологические, генетические и генно-инженерные методы получения микроорганизмов продуцентов. Селекционный отбор и скрининг продуцентов, генетические методы отбора.

Искусственный отбор

Выборка наиболее производительных и неприхотливых образцов микроорганизмов и культивирование их в искусственной среде.

Искусственный мутагенез

Внешнее воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Применение ультрафиолета, радиации, химических веществ для получения необходимой мутации.

Генная инженерия

Выделение необходимых генов и внедрение их в другие организмы, преобразование, «редактирование» ДНК и РНК, создание генетически модифицированных организмов.

Традиционными методами селекции являются ступенчатое клонирование, индуцированный мутагенез с отбором случайных мутантов, отбор по фенотипу, отбор по количественному признаку среди мутантов с определенным генотипом, гибридизация.

Процедура отбора штаммов.

Существуют следующие виды отбора:

Отбор по фенотипу (phenotypic selection) ‒ самый простой способ, когда колонии или мицелиальные ковры отбирают по внешним признакам (цвет, текстура, вертикальный профиль, скорость радиального роста). Под фенотипом здесь понимают только внешнее строение, цвет, особенности споруляции и роста, но не наличие определенных метаболитов.

Направленный отбор (directional selection) ‒ форма отбора, в результате которого происходит смещение средне-популяционного значения признака в сторону, определяемую селекционером.

Дифференциальный отбор (differential selection) ‒ отбор по количественному признаку, направленный на увеличение разницы между средней для вида микроорганизма величиной и средней для отобранных штаммов.

Периодический отбор (recurrent selection) ‒ отбор из популяции микроорганизмов периодически появляющихся быстрорастущих мутантов, в результате чего исходная популяция замещается популяцией с новым генотипом, обладающей более быстрым ростом.

Линейный отбор (line selection) ‒ направленный отбор в ряду поколений по нескольким направлениям, приводящий к созданию линий, в которых отбор продолжается с учетом межлинейных сравнений. Преимущество получают микроорганизмы с определенным уклонением от среднего значения по сравнению с популяцией исходного типа.

Корреляционный отбор (correlated selection), или вторичный эффект отбора ‒ изменение признаков, не подвергающихся прямому отбору, в результате их корреляции с отбираемым признаком.

Тандемный отбор (tandem selection) ‒ улучшение популяции путем отбора поочередно по одному, а потом по другому признаку; оба признака экономически значимы. Производится в ряду поколений. При отрицательной корреляции между признаками эффективность отбора снижается

Скринингом - называют выборочное выделение штаммов, синтезирующих определенный метаболит, несколько родственных метаболитов, или обладающих определенной биологической активностью, из крупной выборки из одного или нескольких природных источников. Выборка может включать как представителей одного вида, так и многочисленные виды бактерий или грибов, составляющих целые сообщества. Скринингом в узком смысле называют выделение мутанта или рекомбинанта, обладающего нужным фенотипом или генотипом, из многочисленной популяции микроогранизмов, например, после обработки мутагеном.

В процессе селекции часто используется минимальная и полная питательные среды, а также селективные среды. Они позволяют выделить прототрофные и ауксотрофные штаммы.

Минимальная среда (minimal medium, defined medium) ‒ питательная среда для культивирования бактерий и грибов, в которую входит минимальное количество соединений, необходимых для их роста и размножения.

Обобщенный состав минимальной среды следующий

1) источник углерода ‒ глюкоза или глицерол;

2) источник азота ‒ ионы аммония (например, в виде соли NaNH4HPO4) или гистидин;

3) неорганические соли ‒ источники ионов Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, SO4 2‒ , Cl‒ , PO4 3‒ ;

4) микроэлементы (trace elements). К микроэлементам относят Mn, Mo, Zn, Cu, Co.

В состав сред микроэлементы, как правило, не добавляют, так как потребность в них может быть удовлетворена за счет следовых примесей в солях макроэлементов .

Селективная среда (selective medium) ‒ cреда для культивирования клеток или мицелиев одного определенного генотипа и не пригодная для роста клеток или мицелиев других генотипов. Может содержать лимитирующий фактор – одно из веществ в количестве меньшем, чем это необходимо для роста микроорганизмов. Полная среда (complete medium, rich medium) содержит все добавки, обеспечивающие рост и размножение любых мутантов с нарушениями синтеза метаболитов. В нее входят частично гидролизованные животные или растительные ткани или гидролизат казеина ‒ для обеспечения микроорганизма аминокислотами, короткими пептидами, липидами; также включает дрожжевой экстракт, содержащий витамины, кофакторы ферментов, предшественники нуклеиновых кислот; остальные компоненты как в минимальной среде.

Полная среда. Прототрофы (prototrophs) ‒ в микробиологии ‒ штаммы бактерий и грибов, способные синтезировать сложные вещества из ограниченного числа простых соединений, и потому растущие на минимальной среде. Еще их называют штаммами, способными к полному синтезу.

Ауксотрофы (auxotrophs) ‒ микроорганизмы, которые в результате мутации утратили способность синтезировать определенные органические молекулы, необходимые для их роста (например, азотистые основания или витамины), и неспособные развиваться на минимальной среде. Жизненно важные соединения в этом случае называют факторами роста. Также ауксотрофами называют бактерии или грибы, которые приобрели, в сравнении с исходными формами, потребность в новых факторах роста. Причина ауксотрофности это, как правило, мутация в структурном гене (мутация недостаточности). Если же молекулярная причина зависимости по фактору роста не установлена, то говорят просто об ауксотрофной мутации (auxotrophic mutation). В их число входит образование ингибитора фермента, при неизменности гена биосинтеза фактора роста. Ауксотрофы часто образуются при обработке прототрофов мутагенами. Ауксотрофные штаммы обозначают тремя строчными начальными буквами латинского названия вещества, по которому они зависимы, или первой буквой латинского названия вещества, написанной заглавно; к обозначению добавляют знак «минус». Например, lys‒ ‒ ауксотрофность по лизину.

При генно-инженерном создании или улучшении штаммов-продуцентов применяют отбор по селективному маркеру ‒ выделение нужных генотипов из популяции, при котором требуемый генотип обеспечивает рост в определенных условиях (например, в присутствии антибиотика).

Селективный посев (selective plating) ‒ это метод выявления рекомбинантных микроорганизмов среди ауксотрофов, путем высева их на минимальную среду. При этом рекомбинация должна сопровождаться восстановлением аллели дикого типа и, соответственно, способности к синтезу соединения, которое отсутствует в минимальной среде. Негативный отбор (negative selection) ‒ выделение из популяции микроорганизмов клеток-трансформантов, при котором их обнаружение базируется на потере одной или нескольких специфических функций. Например, вставка целевого гена в селективный маркерный ген инактивирует последний. Трансформанты выделяются по отсутствию экспрессии маркерного гена .

Вопрос № 2

Использование ферментов для проведения технологических процессов. Методы выделения и очистки ферментов.

Многие ферменты используют в пищевой промышленности. В кондитерском производстве применяется инвертаза дрожжей, превращающая сахарозу в глюкозу и фруктозу, предотвращая кристаллизацию сахарозы при высоких ее концентрациях.

Глюкозоизомераза, иммобилизованная на целлюлозном носителе, применяется для получения глюкозо-фруктозных сиропов с преимущественным содержанием фруктозы. Крупномасштабным производством является получение глюкозы из крахмала с использованием иммобилизованной амилоглюко- зидазы в проточных перемешиваемых реакторах.

Для просветления пива используют протеиназы, в частности папаин, иммобилизованный на хитине. В пивоварении для замены солода используют амилазы. Эти ферменты находят свое применение также при производстве патоки и растворимого крахмала. В хлебопечении амилазы на 30% ускоряют процесс созревания теста, улучшают качество хлеба, предотвращая процесс черствления.

При обработке молока ферменты используют в нескольких технологических процессах.

При производстве сыра одной из основных стадий является коагуляция молока, которая осуществляется при помощи реннина. Для удешевления процесса в ряде случаев применяют бактериальные ренинины, иммобилизованные на нерастворимых носителях. Вкусовые свойства сыра могут быть улучшены за счет укорочения цепи углеродных атомов в результате гидролиза под действием липаз микроорганизмов. Отходом при производстве сыра является молочная сыворотка, содержащая большое количество лактозы. Последняя содержит галактозу и глюкозу, представляющую большую пищевую ценность. Однако получение глюкозы из лактозы при помощи растворимой лактазы нетехнологично, поэтому был разработан метод гидролиза лактозы при помощи иммобилизованной на триацетате целлюлозы лактазы. Для стабилизации молока его обрабатывают протеиназами. Так, обработанное иммобилизованным трипсином молоко меньше подвержено окислению и в течение двух недель не утрачивает своего вкуса.

Целлюлазы используют при приготовлении растворимого кофе, а также при обработке цитрусовых. Кислая липаза применяется в хлебопечении; она катализирует процесс образования моноглицеридов, препятствующих чсрств- лению хлеба.

В кожевенном производстве для обработки шкур применяют препараты протеиназ микробного происхождения, при этом качество сырья значительно улучшается, а время технологического процесса сокращается почти в два раза.

В текстильной промышленности пектолитические ферменты с успехом используют для переработки льносоломы и получения из нее льноволокна. Некоторые протеиназы применяют для обесклсивания шелка и высвобождения шелковых волокон.

Широкое применение нашли ферменты в тонком органическом синтезе. Чаще всего используют гидролитические ферменты, иммобилизованные на растворимых носителях. В частности, гидролазы применяют для модификации пенициллинов и цефалоспоринов. Биокаталитический процесс связан с модификацией боковой цепи антибиотика без изменения его ядра.

Примером может служить производство полусинтетических пенициллинов. Они являются производными 6-аминопенициллановой кислоты, деацилированной формы бензилпенициллина. В настоящее время известно много технологических процессов, в которых используется иммобилизованная пенициллинамидаза, осуществляющая это деацилирование. Полусинтетические пенициллины получают в реакторах периодического действия, иммобилизацию фермента проводят на триацетате целлюлозы.

Выделение и очистка ферментов

Строение ферментов, их свойства и функции можно исследовать только при наличии их высокоочищенных препаратов, в которых отсутствуют кофакторы, способные модулировать их конформацию, следовательно, структурные и функциональные особенности. Получение белка в гомогенном состоянии – сложная задача, поскольку биологический материал, являющийся источником фермента, содержит множество разных белков и их комплексов. Кроме того, трудности получения чистых ферментов связаны с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что снижает число возможных методов выделения, хотя близкие свойства белков в их смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний.

Три основные проблемы при выделении ферментов:

1. Исходный материал состоит из множества различных соединений, разделение которых сложно вследствие того, что они построены однотипно и мало различаются между собой по физико-химическим характеристикам (растворимости или способности к сорбции на определенном типе сорбента).

2. Работа с биологическим материалом зачастую сопровождается необходимостью работать с очень небольшими количествами исходного вещества, поэтому методы детекции должны быть высокочувствительными.

3. Многие белки обладают очень низкой устойчивостью, хотя необходимо выделение фермента в нативном состоянии с сохранением его биологической активности. Многие ферменты при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены денатурации, которая обычно сопровождается их инактивацией. Кроме того, в клетках имеются ферменты, способные разрушить те или иные вещества, в первую очередь белки.

Выбор исходного материала для выделения чистых препаратов фермента определяется целью исследования. Для изучения свойств определенных ферментов, безотносительно источника, выбирают наиболее доступный биологический материал, содержащий большие количества фермента. При исследовании специфических ферментов из конкретных источников используют определенный биологический материал независимо от количества в нем исследуемого фермента, что усложняет процесс его выделения и очистки.

Разрушение клеток и экстракция белков

Первым этапом выделения и очистки ферментов является разрушение клеток и экстракция белковых молекул. Для разрушения клеток используют различные методы – осмотический шок, растирание кусочков ткани с кварцевым песком или стеклянными шариками, размельчение гомогенизаторами различных типов. Метод разрушения клеток и время обработки выбирают в зависимости от типа ткани. Эритроциты обычно подвергают осмотическому шоку. Мягкие ткани (печень, мозг) разрушают с помощью гомогенизатора Поттера. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Для выделения белков, связанных с мембраной, используют детергенты. После экстракции белка гомогенат центрифугируют при 10000-20000 об/мин для удаления нерастворимого осадка. Полученная надосадочная жидкость (супернатант) называется экстрактом.

После получения экстракта, содержащего исследуемый фермент, его подвергают очистке. Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей. На каждой ступени разделения должна получаться фракция более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс часто называют фракционированием. На каждой стадии разделения белок находится либо в виде раствора, либо в виде осадка.

Диализ

Непосредственно перед очисткой ферментов белковые растворы концентрируют. Это можно осуществить методами:

а) осаждения с последующим растворением в меньшем объеме;

б) адсорбции на ионообменнике с последующей элюцией;

в) ультрафильтрации.

После или до концентрирования белковых препаратов проводят их диализ, в результате чего из образца с помощью полупроницаемой мембраны удаляются низкомолекулярные соединения, которые, замещаются буфером. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через полупроницаемую мембрану, а неспособные диализировать коллоидные частицы остаются в ней. Простейший диализатор представляет собой мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая жидкость. Мешочек погружают в растворитель. Постепенно концентрация диализирующего вещества в диализируемой жидкости и растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа крайне низка. Для ускорения диализа увеличивают площадь мембраны, повышают температуру и осуществляют непрерывную смену растворителя. Экстракт, прошедший диализ, называют диализатом.

Вопрос № 3

Особенности проведения биотехнологических процессов, аэробные и анаэробные процессы.

Аэробное дыхание – это окислительный процесс, в ходе которого расходуется кислород. При дыхании субстрат без остатка расщепляется до бедных энергией неорганических веществ с высоким выходом энергии. Важнейшими субстратами для дыхания служат углеводы. Кроме того, при дыхании могут расходоваться жиры и белки.

Аэробное дыхание включает два основных этапа:

- бескислородный, в процессе, которого происходит постепенное расщепление субстрата с высвобождением атомов водорода и связыванием с коферментами (переносчиками типа НАД и ФАД);

- кислородный, в ходе которого происходит дальнейшее отщепление атомов водорода от производных дыхательного субстрата и постепенное окисление атомов водорода в результате переноса их электронов на кислород.

Анаэробное дыхание это биохимический процесс окисления органических субстратов или молекулярного водорода с использованием в дыхательной ЭТЦ в качестве конечного акцептора электронов вместо O2 других окислителей неорганической или органической природы. Как и в случае аэробного дыхания, выделяющаяся в ходе реакции свободная энергия запасается в виде трансмембранного протонного потенциала, использующегося АТФ-синтазой для синтеза АТФ. Осуществляется прокариотами (в редких случаях — и эукариотами) в анаэробных условиях. При этом факультативные анаэробы используют акцепторы электронов с высоким окислительно-восстановительным потенциалом (NO3−, NO2−, Fe3+, фумарат, диметилсульфоксид и т. д.), у них это дыхание конкурирует с энергетически более выгодным аэробным и подавляется кислородом.

Большинство аэробных микроорганизмов окисляет органические питательные вещества в процессе дыхания до С02 и воды. Поскольку в молекуле СО 2 достигается высшая степень окисления углерода, в этом случае говорят о полном окислении и отличают этот тип дыхания от не полных окислений, при которых в качестве продуктов обмена выделяются частично окисленные органические соединения.  Под «полным окислением» имеется в виду лишь то, что не происходит вы деления каких-либо органических веществ; но это вовсе не означает, что окисляется весь поглощенный субстрат. В каждом случае значительная часть субстрата (40-70%) ассимилируется, т.е. превращается в вещества клеток. Конечными продуктами «неполных окислений» могут быть уксусная, глюконовая, фумаровая, лимонная, молочная кислоты и ряд других со единений. Поскольку эти продукты сходны с теми, которые образуются при брожениях (пропионовая, масляная, янтарная, молочная кислоты и др.), а также в связи с тем, что при промышленных процессах брожения необходимы специальные технические устройства (ферментеры), неполные окисления называют также «окислительным брожением» или «аэробной ферментацией». Слова «брожение» и «ферментация» в этом случае отражают скорее технологический аспект.

В настоящее время известен ряд бактерий, способных окислять органические соединения или молекулярный водород в анаэробных условиях, используя в качестве акцепторов электронов в дыхательной цепи сульфаты, тиосульфаты, сульфиты, молекулярную серу. Этот процесс получил название диссимиляционной сульфатредукции, а бактерии, осуществляющие этот процесс — сульфат-восстанавливающих или сульфат-редуцирующих.

Все сульфатвосстанавливающие бактерии — облигатные анаэробы. Сульфатвосстанавливающие бактерии получают энергию в процессе сульфатного дыхания при переносе электронов в электронтранспортной цепи. Перенос электронов от окисляемого субстрата по электронтранспортной цепи сопровождается возникновением электрохимического градиента ионов водорода с последующим синтезом АТФ. Подавляющее большинство бактерий этой группы хемоорганогетеротрофы. Источником углерода и донором электронов для них являются простые органические вещества — пируват, лактат, сукцинат, малат, а также некоторые спирты. У некоторых сульфатвосстанавливающих бактерий обнаружена способность к хемолитоавтотрофии, когда окисляемым субстратом является молекулярный водород.

В качестве акцептора электронов может использоваться фумарат. Фумаратредуктаза сходна с нитритредуктазой: лишь вместо молибдоптерин содержащей субъединицы в её состав входит ФАД и гистидин содержащая субъединица. Трансмембранный протонный потенциал образуется аналогичным образом: перенос протонов не происходит, однако фумаратредуктаза связывает протоны в цитоплазме, а дегидрогеназы в начале ЭТЦ выделяют протоны в периплазму. Перенос электронов с дегидрогеназ на фумаратредуктазу происходит обычно через мембранный пул менохинонов. Фумарат, как правило, отсутствует в природных местообитаниях и образуется самими микроорганизмами из аспартата, аспарагина, сахаров, малата и цитрата. В виду этого большинство бактерий, способных к фумаратному дыханию содержат фумаразу, аспартат:аммиак-лиазу и аспарагиназу, синтез которого контролирует чувствительный к молекулярному кислороду белок Fnr. Фумаратное дыхание достаточно широко распространено среди эукариот, в частности у животных (среди животных, у которых оно описано — пескожил, мидии, аскарида, печеночная двуустка.

Карбонатное дыхание один из видов анаэробного дыхания, при котором в качестве терминального акцептора водорода выступает СО2, который восстанавливается до метана или уксусной кислоты; осуществляют, соответственно, метаногены и ацетогенные бактерии ( ацетогены ).

Прокариоты обладают возможностью использовать в качестве акцептора электрона в дыхательной электронтранспортной цепи вместо кислорода различные окисленные соединения азота. Ферментом, катализирующим финальную стадию транспорта электрона — его перенос на нитрат-анион — является нитратредуктаза нитратное дыхание встречается, хотя и редко, и среди эукариот.