Программа ИБП

Лекция 3.

1. Режимы культивирования. Периодические (batch) режимы

Существуют периодический (Batch/feed-batch) и непрерывный (хемостат, хемостат с перфузией, диализ)

Периодический:

Классический

Закрытая система

Постоянный объем среды

Сбор урожая в момент максимальной плотности клеток и титра продукта + простота, гибкость

- низкий выход, ингибир. действие метаболитов Периодический с подпиткой

Более высокие плотность и титр Типы1)подпитка 2) подпитка+ замена

На графике S – концентрация субстрата Х- концентрация биомассы

Этапы: 1) стерилизация биореактора, вспомогательного оборудования, питательных сред,

2)Загрузка аппарата питательной средой

3)Загрузка посевного материала

4)Рост культуры

5)Синтез целевого продукта

6)Отделение и очистка продукта

7)Мойка аппаратуры

Постоянная/периодическая подпитка, внесение субстрата Варианты:

•продлённое периодическое культивирование, или культивирование с дробным дозированием субстрата - подпитывают культуру периодически добавляя питательные вещества;

•многоциклическое культивирование - часть культуры предыдущего цикла переносят в новую среду;

•отъемно-доливное культивирование - в середине экспоненциальной фазы роста отбирают половину культуральной жидкости, а вместо неё вносят свежую питательную среду.

2. Режимы культивирования. Непрерывные режимы

Непрерывный режим:

Открытая система

Процессы протекают в режиме batch до желаемой плотности

Постоянный подвод среды и отвод культуральной жидкости Типы: с и без удерживания клеток

+большой выход, небольшие биореакторы, меньшие инвестиции

- большие затраты, вымывание клеток, сложная валидация Непрерывное культивирование микроорганизмов - выращивание микроорганизмов в

динамических условиях (в постоянно обновляемой питательной среде). Проводят в специальных биореакторах - хемостатах или турбистатах, которые снабжены устройствами для поддержания температуры и рН на постоянном уровне, а также для автоматической подачи свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости с продуктами метаболизма.

Микробная популяция тем самым поддерживается необходимое время в логарифмической фазе роста. Управление скоростью поступления питательных веществ в проточных биореакторах осуществляется двумя способами турбидостатными хемостатным.

Втурбидистате управление культивированием проводят путем измерения мутности выходящего потока с использованием фотоэлектрического элемента. Скорость разбавления свежей средой устанавливают в зависимости от требуемой плотности выходящей из турбидистата культуры. - для большой скорости роста, определение скорости роста биомассы методом светорассеивания

Вхемостатах управление культивированием проводят путем лимитирования концентрации одного из ростовых факторов в поступающей в хемостат среде (например, концентрацию глюкозы, фосфора, серы), тем самым изменяют плотность микробных клеток в единице объёма среды. – для небольшой скорости роста

3. Основные виды биореакторов для клеточных культур

Биореактор – закрытая система, в которой протекают биохимические реакции. Статические (не перемешиваются): чашка Петри, t-flask, культ мешок Динамические:

1)Механические -внешние (шейкер, вращающийся элемент, качающаяся плтформа, мембранный реактор)

-внутренние (мешалка, невращ. вал-колебания)

2)гидравлические

Биореактор со слоем наполнения 3)Пневматический Барботаж, эйрлифт

4. Статические системы культивирования

Отсутствует перемешивание. Идеально подходят для культивирования инвитро как агрегатных, так и суспензионных клеток

Чашка Петри

Т-сосуды

-используется на ранних стадиях культивирования

-имеют разлияный размер

-Могут иметь завинчивающиеся крышки

Системы культуры multifray

Газопронизываемые мешкииз полиэтилена или тефлона

Биореактор со статической мембранной колбой Модифицированный Т-сосуд с мембраной для газового обмена и замены среды.

Выпускается как для суспензионных клеток, так и прикрепленных клеток. Состоит из 2х частей: для питат среды 1000мл и для клеток 15 мл.

Поверхностная аэрация и постоянное обновление среды на поверхности

Незначительное пенообразование (не нужны противопенные агенты, легче очистка прдукта)

Мешки и платформы доступны от разных производителей

Как правило, однородный пластиковый мешок

Инкубатор не нужен

7. Гидравлически перемешивающие биореакторы

Сюда относятся биореакторы с упакованным слоем

1.Биореакторы с псевдожиженнием:

-частицы/микроносители суспендированы в среде

-частицы пористые и состоят из керамики/смеси керамикис коллагеном

-относительно низкая плотность и плавают

2.Биореакторы с зафиксированным слоем

- стеклянные частицы могут быть как с порами так и без (керамика, поливинилформальд.смола)

+ активный массоперенос к кеткам большое соотношение площадь/объем защита от напряжения сдвига

- неоднородное распределение кислорода в основном для R&D

Перемешивание при турбулентном течении перемешиваемой среды. Перемешивание происходит засчет турбулентных пульсаций 1)нет застойных зон

2)сильное дно и восходящи поток предотвращают оседание клеток 3)предотвращает образование пены из-за интенсивного газового вихря над суспензией 4)не создает никакого выского напряжения сдвига для любого типа клеток 5) способствует массобмену кислорода и СО2 между суспензией и атмосферой

Лекция 4.

1. Для чего нужны одноразовые биореакторы. Плюсы и минусы.

Контейнеры для культивирования (многолуночные планшеты, колба Эрленмейера, сосуд , мешок). Предварительно смонтированные и стерилизованные с помощью гамма-излучения. Оснащены датчиками.

2.Виды одноразовых технологий в биофармацевтике

Одноразовые биореакторы: - волновые перемешиващие

-с мешалкой

-орбитально перемешивающие

-пневматически управляемые системы

3.Перфузионные стратегии культивирования. Плюсы и минусы.

4. Диагностика микоплазм и способы борьбы

Микоплазмы – класс бактерий, однокл М/О, не имеющих клеточной стенки.

Источником контаминации является сыворотка крови животных и внутрилабораторная передача инфекции из окр среды.

Методы индикации и идентификации делят на прямые и косвенные. К прямым относят:

- Классический микробиологический метод выращивания колоний микоплазм на питательной среде - окрашивание препаратов флуорохромами

К косвенным относят:

- иммунофлуорисценция

-ИФА -ПЦР

-флуоресцентная гибридизация

-электронная микроскопия

-использование видоспециф гипериммун сывороток, меченных флуоресценном.

5. Использование тетрациклина при культивировании клеток

Тетрациклин – антибиотик широкого действия, используется в качестве селективного агента в системах клеточных культур. Токсичен для прокариотических и некоторых эукариотических (предотвращает образование полипептидной цепи)

Клетки млекопитающих менее подвержены его влиянию.

Клетки СНО (cell-line яичники китайского хомячка) имеют тетрациклиновый промотр, продукт SEAP (секретируемая щелочная фосфатаза). Среда содержи Плюроник Ф68

Осуществляется 2стадийный процесс:

1)Фаза роста: среда с тетрациклином, чтобы клетки росли, но еще не синтезировали продукт

2)Фаза производства: индуцируемая сменой среды и понижением температуры

Если бы не было тетрациклинового промотора, то происходило бы присоединение активатора к промотору и запуск процесса транскрипции по интересующему нас гену. Но тетрациклин блокирует присоединение активатора транскрипции к промотору и клетки спокойно растут, пока есть среда с тетрациклином. Когда клетки выйдут на стационарную фазу, тогда среду поменяют, то есть старую среду сольют, понизят температуру и в клетках запустится процесс транскрипции по интересующему нас гену.

Лекция 5.

1. Сравнение клеток растений и млекопитающих

Растительные клетки:

-более устойчивы (из-за клеточной стенки)

-сложнее приникать через клеточную стенку АТ и белкам

-хлоропласты, нужен свет для роста

-вакуоль, отходы жизнедеятельности не выходят из клетки, нвозможно использовать даунстрим, необходимо как-то извлекать продукт.

2. Основные типы растительных культур

1)Каллусная (поверхностное культивирование)

-плотные ткани с зонами редукционного камбия и сосудов

-ткани средней плотности с хорошо выраженными меристематическими очагами

-рыхлые ткани, сильно обводненные, легко распадаются на отдельные клетки

2)Суспензионная (глубинное культ-е)

3)Иммобилизированные клетки

4)Органные (культура волосатых корней)

5)Протопластные

6)Эмбриональные

3. Каллусная культура

Каллусная культура – недифференцируемые клетки, образующиеся на раневой поверхности. Они потерявшие спецификацию, тотипотентные – способны дать начало любому клеточному типу организма. Опробковевающая ткань, которая возникает в результате давления пограничных с раной клеток.

Фрагмент специализированных тканей растения (эксплантат) помещают на питательную среду, содержащую фитогормоны и получают культуру каллусных клеток инвитро Каллусная ткань аморфная Фитогормоны: ауксины и цитокинины Этапы:

1)Выбор экспланта

2)Подбор пит среды, условий культ-я

3)Стерилизация растительного материала

4)Изоляция эксплантов

5)Перенос стерильных эксплантов на пит среду

6)Гермитизация

7)Культивирование

8)Отбор каллуса

4. Культура волосатых корней

Корневые культуры способны к синтезу ценных продуктов, но корни растут медленно.

В последнее время клетки корней трансформируют с помощью Agrobacteria  биомасса увеличивается быстрее, высокие биосинтетические способности, экономическая ценность продуктов.

Получение:

1)Нанесение ран и инфицированиеСтерильный эксплант

Введение А.rhizogenez в растительную ткань

2)Сокультивирование растений и гробактерий. Индукция роста Hairy roots, инкубация 25С, темнота, или мало света, ликвидация агробактерий антибиотиками

3)Выделение Hairy roots. Появляются после 21-28 дней после инкубации в месте заражения

4)Поддержание культуры. Твердая среда, жидкая среда с 10 г свежего веса/л

Параметры культивирования: Время удвоения 1-8 дней, пересев каждые 2-4 недели,

-идикаторы стресса: образование каллуса, изменение длины волосков, плотности волосков,

5. Суспензионная культура растительных клеток

Суспензионные культуры – отдельные клетки или группы клеток выращенные во взвешенном состоянии в жидкой среде.

Легко подвергаются воздействию химических веществ.

Получаются путем помещения каллусной ткани в колбу с жидкой пит средой. Клетки в такой культуре находятся в агрегатах (часто). Рост происходит быстрее, чем каллусной. Лучше образуются из рыхлого каллуса.

Преимущества:

-клетки в одинаковой степени доступны для внешнего воздействия

-возможность быстрого набора биомассы для получения БАВ

-легко заменить или обработать пит среду

Культивирование клеточных суспензий: -накопительное -непрерывное

--полпроточное

--проточное

---закрытое

---открытое

6.Эмбриональные культуры и культуры протопластов. Понятие тотипотентности.

Тотипотентность – способность отдельных клеток растения менять программу развития, проходить дифференцировку, вторичную дифференцировку, способность создавать новое растение.

Эмбриональная культура – выращивание зародышей растений, извлеченных в стерильных условиях, в соответствующей пит среде.

Получение: Выбор экспланта введение каллуса на пит среду  размножение (на твердой среде)- субкультивирование/отбор  размножение на жидкой среде  экспрессия  предварительное проращивание  выращивание ex vitro  развитие в полиэтиленовых мешках.

Протопласт – клетка, полностью лишенная клеточной стенки и имеющая только клеточную мембрану, которая ограничивает цитоплазму с различными органоидами и другими включениями. Получаются искусственным путем.

7.Параметры контроля процесса клеточного роста

Прямые методы:

-определение биомассы – гравиметрический анализ =взвешивание

-клеточный объем – объем упакованных клеток=центрифугирование

Потентность (диффиренцирующий потенциал) – способность производить определённое количество разных типов клеток.

Тотипотентные СК могут дифференцироваться в любые клетки эмбриональных и экстраэмбриональных тканей, организованные в виде трехмерных связанных структур могут дать начало полноценному организму. Зигота, клетки, морулы.

Плюрипотентные СК – потомки тотипотентных , дают начало всем тканям и органам, кроме экстраэмбриональных тканей (плацента). Эктодерма, мезодерма, энтодерама. Мультипотентные СК – порождают клетки разных тканей, но ограничены пределами одного зародышевого листка. Эктодерма – нервная система, органы чувств и др. Мезодерма – хрящевой и костный скелет, кровеносные сосуды, почки, мышцы. Энтодерма – органы дыхания и пищеварения.

Унипотентные СК – незрелые клетки, которые уже не являются стволовыми, так как могут производить лишь один тип клеток. Долговременный источник клеток одного конкретного типа, способны к многократному самовоспроизведению. Ограничены определенным числом делений.

Мезенхимальные СК – регенеративная и иммунтерапия. Костный мозг, жировая ткань, пуповина.

Мультипотентные мезенхимальные СК:

Адгезия к пластику инвитро

Способность к дифференциации

Высокая скорость пролифирации позволяет нарастить достаточное количество клеток для трансплантации

Иммуногенный птенциал

Вводятся путем инфузии или инъекции

Терапевтический эффект от миграции к нужной точке, экспрессия перакриновых факторов, дифференциация вблизи гомологичных клеток

Не приводят к образованию опухолей

Легко выделить из ткани

Очень чувствительны к стрессу

Для получения высоких плотностей и хорошего качества клеток  минимум стресса, иначе дифференцировка или апоптоз. Устойчивость к стрессу = среда +микроносители + реактор+парметры.

4. Выделение первичных клеток

Первичные клетки выделяют напрямую из ткани (биопсия, органы или эмбрионы). Разрушение связывания клетка-клетка и клетка-матрикс: протеиназы+агенты, связывающие двухвалентные катионы. Диссоциированные клетки центрифугируют/адгезируют на поверхности роста.

Выделение первичных клеток из тканей:

1)Небольшой кусок ткани разбивается на отдельные клетки или группы клеток механически, ферментативно и комбинируя

2)Клетки очищают от ферментов центрифугированием и ресуспендированием в культуральной среде

3)Клетки инокулируются в специальных стеклянных или пластиковых сосудах с плоским

дном Эпителиальные – кожа/сосуды

Фибробласты – соединительная ткань Мышечные клетки Нервные, лимфоциты

Обработка и удаление мертвых клеток: механическая обработка; техники для первичного экспланта; с помощью энзимов трипсин коллагеназа и другие – центрифугирование – рассуспендирование и посев – первичная культура клеток – замораживание.

5. Микроносители

Метод микроносителей сочетает элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток

1)Равномерные условия по всему объему сосуда

2)Высокая плотность клеточной популяции

3)Значительная экономия пит среды

Материалы: Декстран, коллаген, полимеры, стекло, керамика Плотность примерно 1,02-1,04 г/см3

Поверхность может быть гладкой, так и пористой (клетки не должны проникать в поры) Микроносители – мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на поверхности которых клетки растут в виде монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур. Микроносители должны быть нетоксичными, не сорбировать компоненты питательных сред и продукты метаболизма клеток, а также иметь поверхностный заряд или обменную емкость, достаточную для прикрепления клеток.

6. Основные типы реакторов для чМСК

Одноразовые

Динамические системы

-механически управляемые (поверхность роста обеспечивается микроносителями)

-гидравлически управляемые (поверхность роста обеспечивается биореактором)

Полые волоконные реакторы, быстрое, гибкое, мелкомасштабное производство антител для диагностики и анализа.

7.Терапевтические подходы к трансплантации клеток

1)Аутологичные – собственные клетки;

2)Аллогенный – чужеродные клетки (относящиеся к другой особи того же биологического вида);

3)Ксеногенный – чужеродные клетки (от особи другого вида).

Аллогенные продукты доступны практически мгновенно, аутологичные – нет. Следовательно, аллогенные продукты могут применяться в чрезвычайных ситуациях. Аутологичные продукты обычно производятся, когда возникает необходимость, следовательно обработка/производство находятся на критическом пути (а). Напротив, аллогенные продукты должны быть просто извлечены из хранилища и, т.о., доступны практически мгновенно (b). Аллогенные продукты,

поскольку реципиент не известен заранее, могут быть изготовлены и сохранены когда это удобно, следовательно производство/обработка м.б. оделены от необходимости/использования. Этапы трансплантации:

Терапия Взятие клеток

Замораживание

Ввод размноженного трансплантанта после кондиционирования