4888

Для получения приведенных значений (универсальных для считывания)

а х

применяли формулу Rf 0,75 ;

где а – длина дорожки, мм;

41

х – определяемая (универсальная) длина дорожки, мм; 0,75 – коэффициент, равный длине электрофоретической трубки (подбирается эмпирически);

Экспериментальная часть.

Отобрать почки с каждой формы березы, 1-3 – самофертильные формы, 2 – самостерильная форма.

1.1 н HCl – 48,0 мл; Трис – 36,6 г; TEMED – 0,23 мл;

2.Акриламид – 30,0 г; МБА (метиленбисакриламид) – 0,8 г;

3.ПСА (Персульфат аммония) – 0,14 г;

Растворы для приготовления концентрирующего геля:

4.1 н HCl – 48,0 мл; Трис – 5,98 г; TEMED – 0,46 мл; pH 6,7

5.Акриламид – 10,0 г; МБА – 2,5 г;

6.РФ (рибофлавин) 4 г;

7.Сахароза – 40%;

Электродный буферный раствор:

Трис – 6,0 г; Глицин 28,8 г; используют 10% водный раствор. Проявление гелей на пероксидазу:

Приготавливают два раствора, а) и б) а) 1. Бензидин – 100 мг;

2.CH3COONa – 6 г;

3.ЛУК (ледяная уксусная кислота) 3 мл (подогреть);

4.С2Н5ОН (пищевой) – 50% - 100 мл;

Порядок приготовления: 1-3-2-4, хранится в темноте.

б) Н2О2 – 0,98 мл; Н2О – до 100 мл;

Смешать перед проявлением 1 ч. а) + 1 ч. б); Функция концентрирующего геля – соответственно концентрирует со-

держимое кармана ( экстрагирующий буфер с ферментом + краситель) для дальнейшего прохождения и сегрегации изоформ на следующей стадии – стадии разделения.

Разделяющий гель – дифференцирует фракции ферментов по их электрическому заряду и/или по молекулярной массе.

Приготовление растворов. Растворы для приготовления разделяющего

геля:

42

Схематический рисунок полученного спектра пероксидазы при изоферментном анализе.

Формы березы пушистой

S

I

F

S – медленно движущиеся изоформы;

I – изоформы с промежуточным типом движения; F – быстро движущиеся изоформы.

1,3 – самофертильные формы, 2 – самостерильная.

Вывод: при сравнении указанных форм наибольшей изменчивостью (гетерогенностью) обладает форма № 1 (самофертильная), что говорит о большей приспособленности к изменению условий окружающей среды этих форм при применении данного метода генетического анализа.

Состав компонентов разделяющего и концентрирующего гелей (Davis, 1964).

44

РАБОТА 10. Введение в молекулярно — генетический анализ. Статистическая обработка сиквенсов ДНК в компьютерной программе МЕГА.

Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот и аминокислотного состава белков является начальным этапом исследований в области молекулярной генетики. В настоящее время накопилось достаточно много данных о фрагментарных последовательностях (сиквенсах) ДНК человека, животных, растений, других живых организмов. Уже полностью расшифрован геном тополя (Populus trichocarpa). Для того, чтобы узнать, произошли ли мутации (генные, или точечные) в геноме определенного вида, и проявились ли они фенотипически, необходимо грамотно оперировать с полученными исследователем или взятыми из базы данных (NCBI, EMBL) последовательностью нуклеотидов. В нашей стране методами молекулярно — генетического анализа у древесных занимаются ученые из Института экологии растений и животных РАН (лиственница, В. Семериков), Института Общей генетики РАН (сосна, Д. Политов).

Транзиция — это мутация, обусловленная заменой одного пуринового основания на другое (А↔Г) или одного пирнимидинового на другое (У,Т↔Ц). Частота транзиций (Р) вычисляется по формуле

Р = α / L,

где α — число наблюдаемых транзиций; L – общее число нуклеотидных сайтов.

Трансверсия — это мутация, обусловленная заменой пуринового основания на пиримидиновое и наоборот (А,Г↔У,Т,Ц). Частота трансверсии (Q) определяется по формуле

Q = β / L,

где β — число наблюдаемых трансверсий, L — общее число нуклеотидных сайтов.

Задание 1. Определить количество транзиций и трансверсий на данном сиквенсе ДНК определѐнного древесного растения (дуб, сосна или береза) и подобранного в базе данных EMBL (Европейской Молекулярной Биологической Лаборатории — Веб адрес: http://www.embl.org .

Материал и оборудование.

Компьютер с доступом в Интернет, программа МЕГА 5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Данные сиквенсов ДНК (в электронном или печатном виде).

Пояснения к заданию. Молекула ДНК состоит из нуклеотидов — аденина, тимина, гуанина и цитозина. Обработанные данные с указанного сайта имеют вид TCGAAACCTGCC, где буквы обозначают нуклеотиды. Эти данные в текстовом редакторе (Word). Алгоритм действий:

1. Двойным нажатием открывается диалоговое окно программы

Мега.

45

Запустить Alignment Explorer выбором Alignment|Alignment Explorer/CLUSTAL в командном меню. Для выравнивания берется образец, имеющийся в файле данных сиквенсов (Sequence Data File).

Добавить невыровненный сиквенс из hsp20.fas образца в Alignment Explorer нажатием правой кнопкой мыши выбором Data|Open|Retrieve

Sequences из File menu.

Выберите в меню команду Edit|Select All чтобы выбрать любое место из всей последовательности сиквенса.

Выберите команду Alignment|Align by ClustalW чтобы выровнять выбранный сиквенс, используя алгоритм КлусталW.

Сохраните текущую сессию выравнивания выбором пункта Data|Save Session. Это позволит сохранить текущую сессию выравнивания для будущего редактирования.

Выйдите из Alignment Explorer выбором Data|Exit Alignment Explorer.

Во всплывающем окне появится запрос, желаете ли вы сохранить данные в MEGA формате. Выберите «Да», затем «Сохранить как» в появившемся окне. Введите hsp20_aligned.meg как имя файла, и нажмите «Сохранить». Появится завершающее окно, запрашивающее название для данных. Введите HSP 20 Aligned by MEGA, нажмите «Ok». Данные сохранены и пригодны для дальнейшей работы (экспорту или выравниванию).

Варианты задач по генетике

1.Известно, что растение имеет генотип АаВвссDdEe. Сколько различных типов гамет образует это растение?

2.Скрещивание двух растений сосны обыкновенной, полученных от черных семян, дало около ¾ черных и около ¼ белых семян. Определить генотипы обеих родительских форм.

3.Сосна с плоским апофизом шишек (А) и черными семенами (В) скрещена с сосной, имеющей крючковатый апофиз (а) и белые семена (в). Определить генотипические и фенотипические классы в F2.

4.Нормальное растение гороха скрещено с карликовым: F1 - нормальное. Определить, какое будет потомство: от самоопыления F1, от скрещивания F1 с исходным нормальным, от скрещивания F1 с исходным карликовым растением.

5.Ель зеленошишечной формы скрещена с красношишечной. В F1 половина гибридов имела зеленую окраску шишек. Определить генотип исходных родительских форм, если допустить, что ген А обусловливает красную окраску шишек, а его рецессивный аллель - а – зеленую. Привести схему скрещивания.

46

6.У ночной красавицы при скрещивании растений, имеющих красные (А) и белые (а) цветки, первое поколение (F1) с розовыми цветками. Какая окраска цветков будет у растений от обоих возвратных скрещиваний?

7.Скрещиваются особи АаВвСс х АаввСС. Какую часть в потомстве составят особи с генотипов:

а) АаввСС; б) АаВвСс; в) ааввсс.

8.Популяция состоит из 80 % особей с генотипом АА и 20 % - с генотипом аа. Определить в долях единицы генотипы АА, Аа и аа после установления равновесия в популяции.

9.У березы повислой устойчивость к корневой губке доминирует над восприимчивостью. Биотип шероховатокорой формы березы, поражаемой корневой губкой, скрещен с биотипом, гомозиготным по устойчивости в

этому заболеванию. Определить: а) генотипы и фенотипы гибридов F1; б) генотипы и фенотипы гибридов F2.

10.При скрещивании растения со стерильной пыльцой с растением, у которого пыльца нормальная, получено потомство, в котором ½ фертильных

и½ стерильных растений. Определить генетическую систему растения отцовской формы.

11.Допустим, что у дуба черешчатого эллиптическая форма желудей доминирует над бочковидной. Напишите генотипы всех растений в следующих скрещиваниях:

1) эллиптическая х бочковидная – все потомки эллиптические;

2) эллиптическая х бочковидная - половина потомков эллиптическая;

3) бочковидная х бочковидная – потомки только бочковидные.

12.Определить молекулярную массу гена, контролирующего образование белка, состоящего из 400 аминокислот. Известно, что средняя молеку-

лярная масса нуклеотида 300.

13.Участок гена состоит из следующих нуклеотидов: ТТТ ТАЦ АЦА ТГГ ЦАГ. Расшифровать последовательность аминокислот в белковой молекуле, кодируемой указанным геном.

14. Определить, какие нуклеотиды и-РНК кодируют аминокислоты белковой молекулы в такой последовательности:

а) валин – глицин – лейцин – гистидин; б) треонин – триптофан – серин – аланин; в) лизин – метионин – валин – пролин; г) аланин – лейцин – лизин – треонин.

15.Вычислить частоты генотипов АА, Аа и аа (в %), если гомозиготные особи аа составляют в популяции 1 %.

47

16.Как изменится равновесное распределение генотипов в популяции

(АА = р2 = 0,49) + (Аа = 2pq = 0,42) + (аа = q2 = 0,09) при установлении новой концентрации аллелей А = р = 0,6; а = q = 0,4.

17.Какая генетическая система фертильной отцовской линии будет закреплять стерильность линии ЦИТs rf rf?

18.При самоопылении растений овса, выросших из черных зерен, получили 277 черных, 81 серое и 26 белых зерен. Какому типу взаимодействия генов соответствует наблюдаемое соотношение?

19.Наследуемость в широком смысле трех сортов тополя (Э.С.-38, Мариландика, Хоперский-1) равна 0,74. Какова доля средовой изменчивости?

20.Произойдет ли оплодотворение при прорастании пыльцевых трубок, несущих аллели S3 S4 в ткани пестика с теми же аллелями?

Рекомендуемый библиографический список

1.Абрамова З.В. Практикум по генетике / З.В. Абрамова, О.А. Карлин-

ский – Л.: Колос, 1974. – 208 с.

2.Айала Ф.И. Современная генетика / Ф.И. Айала, Дж. Кайгер - М.:

Мир, 1987; Пер.с анлг.- Т.1.- 295 с., Т. 2.- 368 с., Т. 3. – 335 с.

3.Гуляев Г. В. Генетика.- М.: Колос, 1984.- 351 с.

4.Дубинин Н. П. Общая генетика.- М.: Наука, 1976.- 572 с.

5.Инге-Вечмотов С. Г. Генетика с основами селекции.- М.: Высш. шк.,

1989.- 283 с.

6.Кайданов Л. З. Генетика популяций.- М.: Высш. шк., 1996.- 320 с.

7.Котов М. М. Генетика и селекция: учебник.- Йошкар-Ола, 1997. Ч.1.-

285 с. Ч. 2.- 107 с.

8.Любавская А. Я. Лесная селекция и генетика.- М.: Лесн.пром-сть,

1982.- 285 с.

9.Любавская А.Я. Генетика: учебник для вузов / А.Я. Любавская, М.Г. Романовский, Г.А. Курносов, С.П. Погиба, В.В. Коровин. – М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2005. – 134 с.

10.Петров С.А. Методы определения и практическое использование коэффициента наследуемости в лесоводстве. - М., 1973. – 51 с.

11.Погиба С.П. Генетика: Учебное пособие / С.П. Погиба, Г.А Курносов, Е.В. Казанцева: М.: МГУЛ, 2002. – 136 с.

12.Райт Дж. В. Введение в лесную генетику; Пер. с англ.- М.: Лесн.

пром-сть, 1978.- 470 с.

48

13.Сиволапов А. И. Методические указания для самостоятельной работы по генетике студентов специальности 260400 – ―Лесное и лесопарковое хозяйство‖.- Воронеж, 1995.- 22 с.

14.Царев А.П. Генетика лесных древесных пород. / А.П. Царев, С.П. Погиба, В.В. Тренин - Петрозаводск: Изд-во Петрозаводского гос. ун-та,

2000.- 339 с.

15.Чернодубов А.И. Географические культуры сосны на юге Русской равнины / А.И. Чернодубов, Т.Е. Галдина, О.А. Смогунова. – Воронеж:

ВГЛТА, 2005. – 128 с.

СОДЕРЖАНИЕ

49

Игорь Юрьевич Исаков Алексей Иванович Сиволапов Елена Васильевна Клещева

Генетика Методические указания к лабораторным занятиям для студентов специально-

сти 250201 – Лесное хозяйство, 250203 – садово-парковое и ландшафтное строительство

Редактор А.В. Гладких

РИО ВГЛТА. УОП ВГЛТА. 394613, Воронеж, Тимирязева, 8