4219

21

концентрацию нуклеиновой кислоты в пробе. Оптическая плотность D = 1 A соответствует приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. Соотношение экстинкции 260/280 нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Коэффициент отношения волн 260/280 нм для чистых препаратов ДНК должен укладываться в переделы 1,7 – 2,0. Коэффициент отношения волн 230/260 нм должен быть в переделах 0,3 – 0,9. Выход за параметры этих значений будет свидетельствовать о чрезмерном загрязнении образцов примесями (белки, фенолы, соли и др.). Привести концентрации проб к оптимальному значению путем разбавления водой.

3.4. Протокол постановки ПЦР

Подготовить необходимые компоненты ПЦР-смеси. В штатив с хладагентом поместить пробирки, предназначенные для проведения ПЦР. Рассчитать общее количество компонентов. Навести суммарную смесь в одной пробирке и разнести поровну в остальные. Добавить в каждую пробирку соответствующую ДНК-матрицу и довести водой до конечного объёма.

Состав ПЦР-смеси на 25 мкл: 2,5мкл 10х ПЦР-буфера, 2,5мкл 25мМ MgCl2, 1мкл 10мМ смесь дНТФ (дезоксинуклеотид трифосфаты), 1 ед. Taq- ДНК-полимеразы, по 1мкМ прямого и обратного праймеров, ДНК-матрицы (её объем зависит от концентрации полученной ДНК), деионизованной воды до 25мкл. Перемешать, поместить в амплификатор, запустить необходимую программу.

Классический вид программы ПЦР для амплификатора (стадии со 2 по 4 повторяются циклически в количестве 25-40):

1.Первичный прогрев 95 °С - 5 мин

2.Денатурация 90–95 °С - 15 с. Происходит расщепление двухцепочечной молекулы ДНК.

3.Отжиг 20 с (температура отжига зависит от длины и нуклеотидного состава праймера и устанавливается оптимизированной для используемых праймеров (40–60 °С)).

4.Элонгация 72 °С - 40 с

5.Конечная элонгация 72 °С - 5 мин

6.Хранение 4 °С - ∞

Состав смеси и программа ПЦР могут варьировать и подбираются экспериментально.

3.5. Протокол постановки электрофореза в агарозном геле

Приготовить агарозный гель (сварить) необходимого состава и объёма. Состав 2 % агарозного геля: агароза 2 %,трис-ацетатный буфер 2 % (pH 8,5, 2М трис, 0,5М ЭДТА, уксусная кислота, дистиллированная вода), вода до конечного объема. Необходимый объём геля выбирается, исходя из

22

вместимости заливочного столика электрофоретической камеры. Собрать заливочный столик. После охлаждения геля до температуры 55 °С добавить бромистый этидий (0,01 % от объёма геля), хорошо перемешать и залить в заливочный столик. Вставить гребёнку. Застывший гель переместить в электрофоретическую камеру. Смешать краситель с пробами (их соотношение зависит от кратности красителя, указанной на упаковке). Закрыть камеру и включить источник питания. После окончания электрофореза поместить гель в систему гель-документации для анализа результата.

3.6. Протокол выделения и очистки ампликона из агарозного геля

(на примере наборов Eurugen Cleanup Mini)

Вырезать фрагменты проб из агарозного геля. Поместить вырезанные фрагменты геля в микроцентрифужные пробирки. Взвесить фрагменты геля.

К каждой пробе добавить три объёма (в данном случае объём приравнивается к массе фрагмента геля) «Связывающего раствора». Инкубировать пробы при 53 °С до полного растворения геля, перемешивая. Весь объём пробы перенести в собранные колонки. Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Слить жидкость из собирательной пробирки и добавить в каждую пробу по 700 мкл «Промывочного раствора». Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Удалить жидкость из собирательной части колонки. Центрифугировать колонки при 13 000 g 60 секунд. Колонки переместить в чистые микроцентрифужные пробирки. Нанести дозатором на мембрану колонки 12 мкл «Элюирующего раствора». Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд.

3.7. Протокол постановки секвенирующей ПЦР

Концентрация ДНК-матрицы для расчета количества, используемого на секвенирующую реакцию, определяется спектрофотометрически (см. п. 2.3).

В микроцентрифужную пробирку внести 10 мкл реакционной смеси

(Terminator Ready Reaction Mix, праймер (3 мкМ р-р), ДНК-матрица,

деионизованная вода). Соотношение компонентов подбирается эмпирически. Программа амплификации:

1. Первичная денатурация 95 °С - 1 мин Затем 25 - 30 циклов:

1.Денатурация 95 °С - 10 с

2.Отжиг 50 °С - 10 с

3.Элонгация 60 °С - 4 мин

Охлаждение реакционной смеси до 4 °С - 5 мин Хранение 4 °С - ∞

После секвенирующей ПЦР необходимо провести очистку продукта от непрореагировавших компонентов.

23

3.8. Протокол очистки продуктов секвенирующей ПЦР набором BigDye® XTerminator Purification Kit

Добавить к пробам по 45 мкл буфера «SAMSolution». Тщательно промешать на вортексе «XTerminatorSolution» и быстро добавить к пробам по 10 мкл. Перемешивать в течение 30 минут. Центрифугировать пробы на 1 000 g 2 минуты. Отобрать не менее 10 мкл супернатанта в пробирки для последующего определения нуклеотидной последовательности.

3.9. Протокол определения структуры ДНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 310

Электрофоретический анализ и детекцию провести на секвенаторе ABI PRISM 310 в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией.

1 Подготовка прибора к работе.

Установка ячейки. Открыть двери прибора. В промытую1 dH20 и высушенную ячейку вкрутить три чистые ферулы (верхняя, нижняя, капиллярная). Вставить ячейку в прибор по направляющим металлическим штырям.

Установка шприца. В чистый сухой шприц2 медленно набрать полимер (max 0,8 мл). Протереть шприц. Отвернуть лапку привода шприца на приборе влево. Вкрутить шприц в ячейку (правая верхняя).

Установка капилляра3. Открыть дверцу печки. Поместить конец капилляра в перекрестье каналов ячейки и закрепить боковой ферулой. Второй конец капилляра пропустить в отверстие шайбы крепления электрода и закрепить так, чтобы конец капилляра выступал на пол миллиметра. Расположить просвет капилляра напротив окна детектора, совместив метки и закрыть крышку. Окончательно закрепить капилляр термо-скотчем и закрыть дверцу печки. Поместить свободный конец капилляра в буфер.

2 Запуск прибора.

Включение прибора и заполнение ячейки. Включить прибор. Включить ПК. Запустить ПО – Data collection. Закрыть клапан буферной ячейки: Window>>Manual control>>Function>>Buffer valve close >>Execute. Закрутить верхнюю ферулу и открутить нижнюю. Продавить полимер до выхода из отверстия нижней ферулы: Data collection>>Window>>Manual control>>Function>>Syringe down>>указать Value (для более короткого шага использовать shift down)>>Execute. Закрутить нижнюю и открутить верхнюю ферулу. Продавить полимер до выхода из отверстия верхней ферулы. Закрутить верхнюю ферулу и открыть клапан: Window>>Manual control>>Function>>Buffer valve open>>Execute. Продавить полимер до выхода из отверстия клапана. Закрыть клапан.

3 Калибровка и диагностика.

Калибровка автосемплера: Data collection>>Window>>Manual control>>Autosample colabration>>Tray>>Снимаем адаптер>>Фиксируем капилляр на точке в соответствии с изображением на экране>>Start>>Page up

24

поднимаем автосемплер вверх (shift up – более мелкие шаги), когда закончилось позиционирование, нажать set (нужно обращать внимание, какой текст отображается в диалоговом окне)>>Resume.

Диагностика детектора: Date collection>>File>>New Injection list>>SeQuensingtestsens, sss>>Modute>>Test CCD 4-colour>>Run.

Установка проб. Закрепить пробы на мягких септах. Нажать Tray. Собрать сендвидж и установить его в автосемплер. Нажать Tray. Закрыть дверцы прибора.

Включение печки: Data collection>>Window>>Manual control>>Temperature set>>Value 50>>Execute>>Window>>Status.

Запуск секвенирования: Data collection>>File>>New>>Sequence sample sheet на 96 образцов>>Sample name (назвать образцы, согласно занимаемому месту в штативе)>>Save as>>Закрыть все диалоговые окна для обновления полученной информации>>File>>New>>Injection list>>Выбирать созданный sample sheet (в дальнейшем будет пониматься, как матрикс)>>Выбрать module>>Задать условия электрофореза>>Run.

4 Завершение работы.

Открыть дверцы прибора. Изъять образцы: Tray>>Разобрать и промыть сендвидж>>Tray. Закрыть и выключить прибор.

Примечание:

1 Промывание ячейки. Отсоединить чашку с буфером и капилляр от ячейки, вынуть её из прибора. Последовательно промыть каналы ячейки dH20 через все ферулы пластиковым шприцем. Продуть каналы ячейки воздухом из шприца и дать высохнуть при комнатной температуре.

2Промывание шприца. Отвернуть лапку привода шприца на приборе влево. Data collection>>Window>>Manual control>>Function>>Syring home>>Execute. Открутить шприц, избавить от остатка полимера и десять раз промыть dH20. При необходимости, перед промывкой можно разобрать шприц. Дать высохнуть при комнатной температуре.

3Капилляр вне упаковки и прибора хранить погруженными концами в деионизованной воде.

3.10. Протокол анализа результатов секвенирования

Использование программного обеспечения SeqA6. Запустить SeqA6. Загрузить данные: File>>AddSample(s)…>> в диалоговом окне выделить файлы сырых данных секвенирования с именами образцов, лежащих в папке с именем-датой в директории «Runs»1 >>нажать кнопку «Add Selected Samples»>>Ok. В открывшемся окне выбрать содержимое ячейки «DeySet/Primer» – подходящий набор химии и капилляр. Установить галочку в ячейке «Show». Нажать кнопку > (play). Во вкладке «Sequense» появится нуклеотидная последовательность образца. После анализа (см. инструкцию к ПО) сохранить последовательности образцов.

Использование BLAST. Открыть в браузере страницу http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Выбрать он-лайн приложение BLAST или

25

перейти по ссылке > http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastS earch&LINK_LOC=blasthome. Скопировать последовательность образца из SeqA6 в соответствующее окно ресурса. Запустить анализ>>нажать

<BLAST>.

Примечание:

1 Директория «Runs» обычно расположена по пути: <Корневой каталог>:\AppliedBio\310\Runs.

4. Биотехнология in vitro в лесокультурной практике

Для плантационного лесовыращивания необходимы эффективные и надежные методы получения высококачественного посадочного материала с гарантированным сохранением ценных свойств исходных материнских деревьев.

Разработанная технология микроклонального размножения ценных генотипов тополя, березы и ольхи обеспечивает возможность ускоренного и в массовом количестве получения качественного посадочного материала от лучших экземпляров деревьев, которые плохо или совсем не размножаются черенкованием (традиционным способом), а ее применение позволит перейти на сортовую основу лесовыращивания ценных генотипов.

Для использования данных методических рекомендаций на других близкородственных лиственных породах необходимо провести адаптацию отдельных этапов культивирования с учетом видовой специфики объектов. Особой тщательности подбора питательных сред и условий культивирования требуют этапы получения первичных культур и регенерации растений, а также отработка оптимальных режимов адаптации растений-регенерантов к нестерильным условиям почвы.

4.1.Технологическая схема производства посадочного материала ценных генотипов тополя, березы и ольхи методом

in vitro для создания плантационных культур

Основные этапы микроклонального размножения тополя сереющего и технологическая схема производства посадочного материала ценных генотипов тополя сереющего представлены на рис. 6.

27

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Основная литература

1.Лутова, Л. А. Биотехнология высших растений [Текст] : учеб. /

Л. А. Лутова. – СПб., 2010. – 240 с.

2.Нечаева, М. Ю. Биотехнология в лесном хозяйстве [Текст] : учеб. пособие / М. Ю. Нечаева. – Воронеж, 2006. – 143 с.

Дополнительная литература

Т. Е. Егорова, М. С. Клунова, Е. А. Живухина. – М. : Академия, 2003. – 208 с.

5.Калашникова, Е. А. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии [Текст] : учеб. пособие / Е. А. Калашникова, А. Р. Родин. –

М., 2001. – 73 с.

6.Машкина, О. С. Методические рекомендации по выращиванию посадочного материала сортов тополя сереющего с использованием

технологии in vitro [Текст] / О. С. Машкина, А. И. Сиволапов, Т. М. Табацкая. – Воронеж, 2011. – 30 с.

7.Нечаева, М. Ю. Практикум по биотехнологии для лабораторных занятий по специальности 260400 (250201) – Лесное хозяйство [Текст] / М. Ю. Нечаева, О. А. Землянухина. – Воронеж, 2008. – 41 с.

8.Сельскохозяйственная биотехнология [Текст] : учеб. / под ред. В. С. Шевелухи. – М. : Высш. шк., 2003. – 468 с.

29

Приложение 2 Список химических реактивов и пластиковой посуды на

различных этапах работ для ДНК-анализа

30

Алексей Иванович Сиволапов Игорь Юрьевич Исаков Владимир Алексеевич Сиволапов

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Методические указания по организации и прохождению учебной практики для студентов по направлению подготовки

35.04.10 – Ландшафтная архитектура