19

Тема 5 Взаємовідносини між рослинами і мікроорганізмами

1. Фізіолого-біохімічна діяльність рослин. Кореневі ексудати.

2. Мікроорганізми в ризосфері рослин.

3. Азотфіксуючі мікроорганізми в мікробно-рослинних системах.

4. Сімбіотрофні мікроорганізми. Передінфекційний сигналлінг між бульбочковими бактеріями і рослинами. Формування симбіотичного системи. Біологічна фіксація атмосферного азоту і ферменти азотного метаболізму бульбочкових бактерій. Відмирання і розклад бульбочок. Екологічні та агротехнічні фактори, які впливають на ефективність бобово-ризобіального симбіозу.

5. Асоціативні та вільноживучі діазотрофи

Завдяки фотосинтезу рослинам належить основна роль в збагаченні атмосфери Землі киснем і продукції органічної маси - основи харчових ланцюгів консументів, і в тому числі людини. У процесі еволюції життя на Землі рослинний світ був основою утворення ряду корисних копалин і формування ґрунтової родючості. Рослинний покрив є також важливим фактором регулювання клімату, підтримання водного режиму та стабілізації грунтоутворювального процесу.

Підраховано, що за рік рослини утворюють близько 1000 млрд. т органічних речовин. На ранніх стадіях їх розвитку кореневі виділення можуть становити 7-9% надземної маси, а загальна кількість речовин, що виділяються кореневою системою за період вегетації, - від 2 до 25% загального обсягу засвоєного в процесі фотосинтезу вуглецю. У перерахунку на суху речовину це становить 0,3-7,2 т / га. Така значна кількість речовин, що виділяється кореневою системою, сприяє формуванню навколо кореня специфічної зони, що називається ризосферою. Ризосфера - місце активного розвитку бактерій, грибів, комах, безхребетних.

До складу пулу кореневих виділень рослин входять різні речовини, що формують фізичні та хімічні властивості ґрунту, такі як мікроагрегатний склад, селективна адсорбція, або зв'язування окремих іонів, утримування зв'язаної води. Кореневі ексудати також стимулюють або інгібують розвиток мікроорганізмів, безхребетних або насіння інших рослин. Кореневі ексудати включають протони і іони гідроксилу (наприклад, водорозчинні цукри), а також карбоксил аніони (наприклад, органічні кислоти). Крім того до складу ексудатів входять азотовмісні сполуки (наприклад, амінокислоти) і широке коло вторинних метаболітів, що виконують роль молекулярних сигналів. Традиційно за хімічним складом кореневі ексудати можна поділити на низько- і високомолекулярні. За кількістю переважають низькомолекулярні: органічні кислоти, амінокислоти і цукри, в менших кількостях виявлені аміди, олігопептиди, пуринові і піримідинові основи, спирти, алкалоїди, глікозиди, поліфеноли, лактони та ін. Спектр органічних кислот складають кислоти циклу Кребса, а також саліцилова, корична, хлорогенова, метілуксусная, фенілпропіонова, 2-фуранакрілова, лимонна, щавлева і яблучна. Є відомості і про наявність у складі кореневих ексудатів цис-аконітової та вугільної кислот.

Серед вуглеводів ідентифіковані глюкоза, альдози, арабіноза, ксилоза, рафіноза, рибоза, манноза, фруктоза, галактоза, сахароза і лактоза. Всі моносахариди беруть участь у синтезі глікозидів, амінокислот, поліфенолів і можуть входити до складу олиго- і полісахаридів. Останні, поряд з протеїнами, відносяться до високомолекулярних кореневих ексудатів.

Полісахариди складають основну частину муцігеля, що покриває верхівку зростаючого кореня. Найчастіше полісахариди утворюють комплекси із зарядженими карбоксильними групами органічних кислот, а також з нейтральними цукрами, білками, фенольними сполуками. Фізіологічна роль полісахаридів багатогранна. Вони можуть бути структурними елементами, запасними продуктами, енергетичними резервними речовинами, виконувати захисну функцію, забезпечувати імунологічні реакції і неспецифічні міжклітинні взаємодії, у тому числі і при формуванні бобово-ризобіального симбіозу.

Встановлено, що фракції органічних кислот відіграють основну роль у забезпеченні ризобактерій джерелом енергії. З використанням молекулярно-біологічних методів на прикладі люпину було показано, що органічні кислоти, що виділяються корінням рослин, впливають не тільки на чисельність мікроорганізмів у ризосфері, а й на структуру мікробного співтовариства. Так, бактеріальне (прокаріотичне) співтовариство тісно пов'язане з виділенням цис-аконітової, лимонної і яблучної кислот; співтовариство еукаріотичних організмів - з лимонною кислотою.

У прижиттєвих кореневих виділеннях вищих рослин присутні сполуки, в молекулах яких міститься бензойне кільце і одна або декілька гідроксильних груп - флавоноїди. Молекула флавоноїду має два бензойних і одне гетероциклічне ядро, що включає кисень (піранове кільце). Група флавоноїдів включає три основні підгрупи, які класифікують за місцем приєднання кільця В до пропанового фрагменту:

• 1-а підгрупа - власне флавоноїди, еуфлавоноіди, 3-діфенілпропаноіди;

• 2-а підгрупа - ізофлавоноїди, 2-діфенілпропаноіди;

• 3-а підгрупа - неофлавоноіди, 1-діфенілпропаноіди.

В даний час відомо близько тисячі ізофлавоноїдів рослинного походження. Особливо багаті флавоноїдними сполуками представники родин бобових, гречаних, айстрових, зонтичних і рожевих. Флавоноїди тісно пов'язані з процесами росту та розвитку рослин. Вони володіють фізіологічною активністю і можуть бути регуляторами рівня ауксинів, бути активаторами або інгібіторами багатьох обмінних процесів. Відомо, що речовини фенольної природи можуть ініціювати або пригнічувати експресію генів, необхідних для здійснення взаємодій рослини-господаря з мікропартнером, тобто виступати у ролі сигнальних речовин. Повною мірою це стосується процесу формування бобово-ризобіального симбіозу. Флавоноїди відповідальні також за формування везикулярно-арбускулярной мікоризи. Фенольні сполуки, синтезовані рослинами, можуть проявляти також захисний ефект проти бактеріальних інфекцій. Механізм цього ефекту реалізується через пригнічення факторів вірулентності патогенів.

У хеморізноманітті кореневих ексудатів слід зазначити компоненти з антимікробною активністю. Наприклад, у складі кореневих виділень базиліка пахучого (Ocimum basiscum) була виявлена розмаринова кислота, синтез і продукування якої починалося у відповідь на дію екстракту з фітопатогенних грибів Phytophtora cinnamoni, Pythium ultimum. Розмаринова кислота надавала антімікробний вплив і на інші мікроорганізми, наприклад, Pseudomonas aeruginosa.

Вищі рослини синтезують природні регулятори росту (фітогормони). З них найбільш вивчені ауксини, цитокініни і гібереліни. За сучасними уявленнями саме фітогормони забезпечують трансдукцію сигналів зовнішнього середовища і регуляцію генної експресії в рослинах. Фітогормони, що надходять у ґрунт з кореневими ексудатами, мабуть можуть брати участь у взаєминах рослин з іншими членами фіто- і біоценозу. Флавоноїди і ростові гормони рослин можуть впливати на процеси колонізації рослин ендофітами, асоціативну азотфіксацию і пригнічувати активність трансмембранних систем патогенних мікроорганізмів.

Частина речовин, утворених рослиною, виходить з коріння назовні в результаті обмінної адсорбції на необхідні їм мінеральні іони. Інша частина екскретується активно, регулюючи взаємини рослин з біотою. Обсяг надходження у ґрунт кореневих ексудатів і наявність у них біологічно активних речовин сприяє створенню в прикореневій зоні специфічних мікробних спільнот, що піддаються сукцесії в процесі росту і дозрівання рослин.

Багато з речовин, що виділяються кореневою системою рослин, не тільки активно споживаються мікроорганізмами, але і в процесі хемотаксису виконують для них роль атрактантів (приваблювачів).

У дослідах з бульбочковими бактеріями люпину було показано, що, незалежно від штамових особливостей ризобій, активними аттрактантами для них були глутамінова кислота, аланін, тирозин, глюкоза і галактоза. Наявність в живильному середовищі перерахованих речовин забезпечувало інтенсивний ріст бактеріальних культур.

Ексудати, що виділяються прорастаючим насінням і корінням рослин, відіграють важливу роль в їх доконтактній взаємодії з мікроорганізмами. Розпізнавання партнерів відбувається у формі «сигналінга» - обміну специфічними сигнальними молекулами. В їх ролі з боку рослин виступають ферменти, вітаміни, алкалоїди, гормони, глюкозиди, речовини флавоноидної природи і білки лектини; з боку мікроорганізмів – глікополімери. Найбільш вивченою моделлю сігналінга може служити процес формування бобово-ризобіального симбіозу. При цьому лектини бобових можуть виступати в ролі молекулярного рецептора, що комплементарно зв'язує глікополімери мікросімбіонта на етапі «впізнавання» рослини бактеріальної клітиною, а також в якості молекулярного сигналу і модулюючого фактора, що здійснює контроль над процесом формування і функціонування симбіозу. Доведено, що лектини гороху можуть виступати в ролі хемоеффектора і позитивно впливати на ріст R. leguminosarum.

До складу кореневих виділень входять хімічні речовини, які надають інгібуючий вплив на патогенні мікроорганізми. Таке явище алелопатичного придушення фітопатогенів назвают біофумігаціей. Алелопатія - властивість одних організмів (мікроорганізмів, грибів, рослин, тварин) виділяти хімічні сполуки, які гальмують або пригнічують розвиток інших. Було відзначено, що після культури капусти зменшується ураження наступних культур фітопатогенними грибами. У складі кореневих виділень капусти виявили ізотіоціанати. Лабораторні дослідження і вегетаційні досліди показали, що ці сполуки значно знижують рівень ураженості злакових патогенними грибами.

Отже, екологічна роль кореневих виділень полягає в нормалізації надходження води і поживних речовин у рослини та формуванні умов функціонування мікроорганізмів ґрунту.

Мікроорганізми в ризосфері рослин

Загальна чисельність мікроорганізмів у ґрунті залежить від температури навколишнього середовища, вологості і забезпеченості джерелами живлення, може коливатися від сотень тисяч до десятків мільярдів клітин в 1 г ґрунту, в результаті чого їх біомаса може досягати 10 т / га орного ґрунту. Вважається, що таких величин може досягати і біомаса грибів. За даними ряду авторів, мікроорганізми становлять 60-90% ґрунтової біоти, а їх фізіологічна активність вище, ніж фізіологічна активність макроорганизмів, хоча на ріст і розмноження мікроорганізмів істотно впливають конкурентні взаємини з рослинами за субстрат.

Особливо багато мікроорганізмів у кореневій зоні рослин, в якій накопичуються кореневі ексудати. За образним визначенням Мак Мілан зона кореневої системи мікроорганізмів є «оазисом активного життя в ґрунті».

Коренева зона заселяється специфічними мікроорганізмами, які пристосовані до кількісного і якісного складу ексудатів певної рослини. За інтенсивністю заселення мікроорганізмами кореневої зони рослин у вітчизняній літературі прийнято розрізняти гістосферу - поверхневі тканини коренів, різоплану - шар ґрунту в кілька міліметрів, безпосередньо прилеглий до коріння, і ризосферу - ґрунт, віддалену від коренів на 0,5-1 см. О. С . Huisman досліджував відстань від кореня, на яку діють ексудати на мікроскопічні гриби. Виявилося, що для більшості досліджених видів вона становить 1 мм, для Rhizoctonia - 5 мм, для Gaemannomyces graminis - 12 мм.

Вивчення зміни бактеріальних компонентів у ризосфері в процесі вегетації рослин показало, що на початкових етапах їх росту в грунті домінують грамнегативні бактерії - псевдомонади, флавобактеріі, азотобактер та ін. У міру старіння рослин в мікробних співтовариствах домінують грампозитивні бактерії - бацили, мікобактерії, стрептоміцети. Особливістю сукцессії є заміна бактерій, що харчуються продуктами екзоосмоса рослин на гідролітики, які харчуються кореневим опадом, що розкладається, старими корінцями і біомасою відмерлих бактерій. Причиною зміни складу мікробних спільнот у процесі вегетації рослин є зміна складу кореневих виділень, які є для них джерелом живлення.

Саме в кореневій зоні з найбільшою активністю проявляються всі позитивні і негативні сторони взаємин мікроорганізмів з рослиною. Серед позитивних взаємовідносин найбільш істотними є оптимізація поживного режиму рослин (постачання їх основними біогенними елементами і мікроелементами), фітогормональної регуляція росту та розвитку рослин, біоконтроль над фітопатогенами та шкідниками, індукція резистентності рослин до захворювань, біодеструкція ксенобіотиків та поллютантів. Бактерії кореневої зони здійснюють ці взаємини, об'єднані під загальною назвою «ризобактерії, що сприяють росту рослин» - Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Цей термін в 1978 р був запропонований F.J.W. Kloepper і співавт.

Негативна сторона взаємодії рослин з мікроорганізмами кореневої зони полягає в інгібуванні росту, розвитку патогенних процесів, що призводять до захворювання рослин, інгібуванні розвитку корисних PGPR.

Дія PGPR на рослину може бути прямим і опосередкованим. Механізм прямої дії полягає в основному в наступному:

• забезпеченні елементами мінерального живлення за рахунок фіксації атмосферного азоту діазотрофами, солюбілізації фосфору фосфатмобілізуючими бактеріями;

• хелатування мікроелементів (в основному заліза) бактеріальними сідерофорами, внаслідок чого іони металів стають більш доступними корінням рослини;

• регулюванні росту й розвитку рослин бактеріальними метаболітами фітогормональної природи.

Непрямий вплив РGPR на рослину полягає в пригніченні розвитку фітопатогенів; синтезі антибіотичних речовин; продукуванні ферментів, що викликають лізис клітинної оболонки фітопатогенів; конкуренції з останніми за джерело живлення і заселення коренів, індукції у рослин резистентності до захворювань.

Узагальнивши сучасні дані про позитивні і негативні ефекти взаємодії ризосферних мікроорганізмів з рослинами, А. М. Воронін та співавт. запропонували схему, яка відображає основні функції ґрунтової мікрофлори в прикореневій зоні (показати схему).

Для колонізації коренів PGPR-бактеріям необхідні такі якості, як здатність виживати і розмножуватися на поверхні коренів, пристосовуватися до кореневих ексудатів, протистояти впливу інших мікроорганізмів. Для формування мікробно-рослинної системи бактерії повинні володіти хемотаксисом до кореневих ексудатів, здатністю синтезувати специфічні поверхневі компоненти, а також почуттям кворуму.

Багато уваги приділяється дослідженню топографії ризосфери. Бактерії щільно заселяють поверхню коренів. За даними мікроскопії, вони знаходяться на відстані 0,03 мм від поверхні коренів у біоплівках. Щоб взаємодіяти з коренем, мікроорганізми повинні розташовуватися на відстані дифузії ексудатів. Ризосфера формується, коли молодий корінь з'являється в певному ґрунтовому осередку і відмирає разом з відмиранням кореня, видозмінюючись і здійснюючи розкладання кореневих залишків.

Відомо, що кінчик зростаючого кореня (апекс) оточений чохлом із слизу, що оберігає його від механічних і біологічних пошкоджень. Формування цього чохла відбувається за участю «прикордонних» клітин, які, відділяючись (злущуючись) від поверхні кореня, виділяють такі речовини, які можуть використовуватися мікроорганізмами в якості джерела вуглецю. Ці речовини утилізуються мікрофлорою прикореневої зони і активізують її хемотаксисну активність. Досягаючи високої чисельності, мікроорганізми навколо кореня утворюють муфту, а на його поверхні - біоплівки, мікроколонії або різні агрегати. Прикріплення клітин, необхідне для утворення плівки, здійснюється за допомогою адгезинів - полісахаридів і поверхневих білків. Найбільш повно вивчені механізми прикріплення ризобій до поверхні коренів бобових рослин, прикріплення агробактерій до коріння дводольних і однодольних рослин і утворення ними пухлин.

У біоплівки ризосферні мікроорганізми тісно пов'язані між собою як просторово, так і метаболічно. Тісні структурні взаємовідношення мікроорганізмів у біоплівках сприяє інтенсивному обміну метаболітами, а також генетичним матеріалом, що визначає більш ефективну адаптивну мінливість у співтоваристві.

Останнім часом велика увага приділяється сенсорним молекулам, що формує «систему почуття кворуму» (Quorum Sensing System - QSS), яка контролює експресію генів, що визначається щільністю бактеріальної популяції. Quorum Sensing (QS) – особливий тип регуляції експресії генів бактерій, що залежить від щільності їх популяції. Наприклад, у фітопатогенних мікроорганізмів така система запускає інфекційний процес. QS-системи містять два обов’язкові компоненти: низькомолекулярний регулятор (аутоіндуктор), який легко дифундує через клітинну мембрану, та рецепторний регуляторний білок, з яким аутоіндуктор (АІ) зв’язується. У міру того як популяція бактерій зростає і досягає критичного рівня, AI накопичуються до необхідного порогового значення та взаємодіють із відповідними регуляторними білками, що викликає різку активацію (індукцію) експресії певних генів бактерій. За допомогою AI здійснюється комунікація бактерій – передача інформації між окремими клітинами бактерій, що належать до одного і того ж або до різних видів, родів і навіть родин; тому сигнальні молекули вважають «словами» у цій своєрідній «мові» бактерій. Першим з описаних варіантом «почуття кворуму» є luxI/luxR-подібні системи грамнегативних бактерій. Під контролем гена luxI синтезується сигнальна молекула-аутоіндуктор, який дифундує в навколишнє середовище, а при досягненні критичної щільності популяції та обумовленою цим власної порогової концентрації здійснює зворотний рух всередину бактеріальної клітини, де, зв'язуючись з регуляторним білком LuxR, утворює комплекс, що зв’язується з промотором цільових генів і запускає їх транскрипцію.

Таким чином, QSS є формою внутішньопопуляційної міжклітинної комунікації між бактеріями, яка здійснюється за допомогою низькомолекулярних аутоіндукторів. У грамнегативних бактерій таку функцію виконують молекули ацілгомосерінлактона (АГЛ), у грампозитивних - сигнальні пептиди. Ацілгомосерінлактон може швидко розкладатися в ризосфері.У той же час корені можуть продукувати подібні сполуки і таким чином брати участь у регуляції мікробного співтовариства ризосфери. Це було доведено в дослідах з кореневими виділеннями гороху (Pisum sativum).

Прикріплення мікроорганізмів до поверхні кореневих волосків рослин починається з перших хвилин контакту і може бути різної тривалості. Бактерії, що несуть на своїй поверхні складний комплекс молекул різної природи, кріпляться або боком, або одним зі своїх полюсів. Вважається, що полярно розташовуються ті ризобії, які під впливом кореневих ексудатів сформували полісахаридну капсулу. Відповідальним за перший етап прикріплення бактерій родини Rhizobiaceae до кореневого волоска є білок рікадгезін, розташований на поверхні мікроорганізму і має молекулярну масу 14 кДа.

У 70-80-ті роки минулого сторіччя в ЕПС і 0-антигенної частини ЛПС ризобій були виявлені рецептори, відповідальні за взаємодію з лектином рослин.

Проникнення ризобій і фітопатогенних бактерій в тканини кореня рослин відбувається після розм'якшення його стінки під впливом пектолітичних ферментів мікроорганізмів.

Серед ризосферних бактерій, які активно колонізують кореневу систему рослин, зустрічаються і такі, які проникають всередину коренів, долаючи бар'єр ендодерміса, проходять через кореневий кортекс до судинної системи рослин і потім як ендофіти розвиваються в стеблах, листі, бульбах і інших органах. Таким чином, ризосферні мікроорганізми можуть брати участь в освоєнні філо- і ендосфери.