Микробные препараты для сельского хозяйства / Тема 4
.docxТема 3. Ентомопатогенные грибы
1. Механізм ураження та розвиток грибної інфекції у тілі комах.
2. Найбільш поширені грибні хвороби комах: мускардіоз, цефалоспоріоз, аспергільоз, вертіцельоз, ентомофтороз. Механізм інфекцій, спектр дії.
3. Основи виробництва грибних інсектицидних препаратів. Поверхневе, глибинне та поверхнево-глибинне культивування ентомопатогенного грибу Beauveria bassiana.
1. Грибные болезни имеют наибольшее значение среди заболеваний, вызывающих значительную смертность насекомых. Эти болезни гораздо легче заметить простым глазом, т.к. мицелий гриба прорастает не только через все тело насекомого, но часто им покоыта поверхность тела и даже прилежащие участки субстрата. Тело насекомого, пораженное микозом, не разлагается, а обычно сохраняет исходную форму, целиком заполняясь нитями мицелия – гифами.
Наряду с подлинно энтомопатогенными грибами, когда признаки болезни проявляются на еще живых особях, известны случаи, когда грибы развивались на уже поврежденном каким-либо физическими факторами теле хозяина или на трупах погибших насекомых. При грибных заболеваниях насекомых большое значение имеет состояния хозяина, а также важно влияние дозы возбудителя на развитие болезни. Энтомопатогенные грибы могут быть узкоспециализированными, паразитирующие только на одном хозяине и даже только на определенной стадии его развития, в других случаях они мало специализированы и способны заражать насекомых многих видов, родов, семейств и даже более высоких таксономических групп.
Некоторые виды грибов очень тесно связаны с определенным хозяином, как например, виды семейства Entomophthoraceae, обладающие высокой избирательностью, поражают только определенных хозяев и очень плохо развиваются на искусственных питательных средах. Другие грибы, такие как представители родов Sporotrichum, Cephalosporium, Beauveria, развиваются не только в насекомых, но и на мертвых органических остатках – на листьях, коре, семенах растений. Поэтому их патогенность для насекомых в известной мере является частным проявлением среди других возможностей.
Пути заражения грибными инфекциями. Заражение грибными болезнями болезнями видов насекомых, обитающих на суше, в большинстве случаев связано с проникновением гиф гриба через кожные покровы насекомых. В этом имеется определенное сходство с действием на насекомых контактных инсектицидов. Споры грибов прилипают к покрову насекомого своей несмачивающейся маслянистой поверхностью, в месте соприкосновения спора прорастает и ростовая трубка проникает через хитиновую кутикулу в тело насекомого. Проникновению ростовой трубки способствуют ферменты (в первую очередь хитиназа), выделяемые грибом в месте прорастания споры, которые размягчают хитиновый покров и образуют в нем отверстие, через которое гриб и проникает внутрь тела насекомого.
Грибная инфекция может проникать в тело насекомых также через ротовое отверстие. Таким путем попадают в пищеварительный тракт главным образом споры водных видов грибов Coelomycidium, Coelomomyces. Однако споры дейтеромицетов также могут проникать в кишечник с пищей и там развиваться, как это установлено для взрослых насекомых.
Третий путь заражения насекомых спорами грибов – их проникновение через дыхальца (Fusarium solani).
Четвертый путь проникновения грибной инфекции в тело насекомых – отверстие полового аппарата. Меланоз ячичника проявляется у пчелиных маток, в яичники которых споры грибов проникают через половое товерстие после выхода их из пищеварительного тракта.
Развитие грибных болезней в теле насекомых. Первый период развития микозов в насекомых обычно связан с массовым образованием коротких гиф гриба (гифальные тельца), которые с гемолимфой разносятся по всему организму.
В следующей фазе у многих видов проявляются иного типа нити мицелия, а на некоторых из них – короткие ветвящиеся отростки со спорами или конидиями. В третьей фазе развития микозов в одних случаях внутри тела хозяина происходит созревание покоящихся спор, в других – гифы гриба прорастают наружу и на поверхности тела разрастаются в густой мицелий, из которого образуются спороносные отростки с конидиями или покоящимися спорами.
Как и при других болезнях насекомых, интенсивность развития болезни зависит от формирования в теле хозяина пригодных для паразита тканей, а также от восприимчивости хозяина. Искусственными мерами можно понизить устойчивость хозяина к возбудителю (например, повышением влажности среды). Защитные силы насекомого – фагацитоз, клеточная и гуморальная защита – способны лишь на короткий срок задержать инвазию гриба. Бывает фагацитоз лишь единичных гиф гриба. Для Beauveria bassiana показано, что на начальной стадии развития микоза гифальные тельца имеют недостаточно сформированную клеточную стенку. Отсутствие таких важных антигенных компонентов, как галактоманан, а также структурных компонентов (хитина) на поверхности гифальных телец делает их нечувствительными к действию клеточных механизмов защиты хозяина. Продукция материала клеточной стенки гифальных телец отмечается на 2-3 сутки после заражения, в это время гемоциты утрачивают способность к фагоцитозу в результате иммунодепрессивного действия грибных метаболитов. Гибель насекомого наблюдается в результате нарушения циркуляции гемолимфы, связанного с массовым образованием гифальных телец и образованием другого типа гиф, проникающих во все ткани организма и вызывающих поглощение из них всех питательных веществ. В редких случаях микозные болезни насекомых сопровождаются признаками интоксикации хозяина.
Некоторые грибы из хитридиевых поражают лишь какой-либо один орган хозяина, полностью разрушая его и заполняя покоящимися спорами. При этом хозяин погибает лишь в стадии куколки и споры высвобождаются из трупа в водную среду. При большинстве болезней мицелий гриба проникает во все органы тела. Энтомопатогенные грибы проходят в организме хозяина только один цикл развития, от прорастания спор до нового их образования.
При заражении грибными болезнями важное значение имеет возраст и стадия развития насекомого. Некоторые грибы, как, например, Beauveria, Metarrhizium, Cordyceps, Spicaria, заражают как личинок, так и взрослых насекомых. В тех случаях, когда взрослые насекомые и их личинки живут в различных условиях, каждая из этих стадий поражается своей специфической болезнью. Возраст насекомых имеет значение при заражении многими болезнями. Энтомофторовые грибы часто поражают более старых и взрослых насекомых, ослабленных после откладки яиц. Такие патогены особенное влияние на численность популяции насекомого не оказывают. Старые особи менее устойчивы и к дейтеромицетам, часто становятся их жертвой. Во многих случаях грибы растут на таких насекомых как сапрофиты, проникая в их тело непосредственно перед смертью. Совсем молодые особи насекомых также более восприимчивы к дейтеромицетам в связи с тем, что имеют более тонкий хитиновый покров. Для заражения таких особей требуется меньшее количество спор.
На развитие болезней в известной мере оказывает влияние температура среды. Так виды Beauveria, Metarrhizium лучше всего развиваются при температуре 26 ˚С, однако они способны заражать и развиваться в хозяине при 10˚С. Для роста гриба Aspergillus flavus оптимум температуры 32-45 ˚С, аналогичный температурный оптимум имеют тропические представители рода Cordyceps.
Данные о влиянии влажности воздуха сводятся к тому, что для развития грибных болезней необходима высокая влажность (выше 90%). Следует иметь в виду, что такая высокая влажность обычно создается несколько раз в течение суток при понижении и повышении температуры и, помимо того, каждый живой организм (насекомое, лист растения) образует вокруг себя тонкий воздушный слой, насыщенный водяными парами. Высокая влажность необходима грибу во время прорастания спор и в период отделения конидий от конидиеносцев.
Большое значение при заражении насекомых имеет вирулентность спор и их количество в окружающей среде. Степень вирулентности спор определяется скоростью прорастания, процентом проросших спор и способностью ростовой трубки проникать внутрь тела насекомого. В результате заражения определенного хозяина можно через несколько пассажей отобрать линию (расу) гриба, интенсивнее и быстрее развивающуюся в этих насекомых. Наоборот, споры, полученные на неспецифичном для гриба субстрате, очень часто совершенно не заражают насекомых, хотя по внешнему виду ничем не отличаются от вирулентных спор. Заражение насекомых энтомопатогенными грибами и возникновении эпизоотии возможны лишь при наличии инфекции в количестве не ниже определенной пороговой дозы. Поэтому, хотя в почве и содержатся споры грибов, их количество не всегда достаточно для того, чтобы вызвать массовое заболевание обитающих здесь насекомых.
2. Известны сотни видов энтомопатогенных грибов, но наиболее перспективными для биометода считаются мускардиннные грибы и энтомофторовые. Основное внимание привлекают следующие грибные патогены: возбудитель белой мускардины (род Beauveria), возбудитель зеленой мускардины (род Metarhizium) и Enthomophthora, (поражающий сосущих насекомых). Наибольшее число видов, представляющих практический интерес для биологической защиты растений, относятся к классам зигомицетов и несовершенных грибов.
К классу зигомицетов относится семейство Entomohhthoraceae. Энтомофторовые грибы образуют внутри питающего субстрата слаборазветвленный мицелий без перегородок с большим количеством жировых капель. В пораженных насекомых мицелий распадается на отдельные элементы – гифальные тельца, которые разносятся гемолимфой по телу хозяина и постепенно заполняют его, замещая разрушенные ткани. Продолжительность периода от прорастания конидий до гибели при поражении крупных насекомых (саранча) составляет 5-8 дней, мелких (тли) - 2-3 дня. Гифальные тельца прорастают в мицелий, выходящий на поверхность тела погибшего насекомого в виде бархатистого налета. Этот налет состоит из сплошного слоя конидиеносцев, образующих на концах по одной большой конидии различной формы. Конидиеносцы простые (р. Empusa) или разветвленнык (Entomophthora). Конидии одноклеточные, тонкостенные, с зернистой плазмой и жировыми каплями. Стенки конидий гладкие, основание более или менее сосочковидное. Особенностью энтомофторовых грибов является выстреливание зрелых конидий со значительной силой на расстояние, в тысячи раз превосходящее их размеры. Кроме конидий образуются также покоящиеся споры, которые могут переживать неблагоприятный для развития зимний или засушливый период. Весной такие споры являются источником инфекции для восприимчивых насекомых. Некоторые виды рода энтомофтора образуют ризоиды, которые прикрепляют тело погибшего насекомого к субстрату. В таком состоянии насекомые могут сохраняться до весны.
Энтомофторовые грибы – облигатные узкоспециализированные паразиты. Наиболее широко распространены представители родов Empusa и Entomophthora. Empusa grilli – возбудитель микозов саранчовых, E. aulicae поражает вредителей лесных культур – сосновую совку, златогуза, кольчатый шелкопряд. Entomophthora spaerosperma вызывает массовые заболевания капустной белянки и капустной моли, E. thraxteriana поражает тлю.
На основе спор гриба рода Entomophthora разработаны препараты Микоафидин и Микоафидин Т, используемые против гороховой и персиковой тли, соответственно. Норма расхода препарата 3-6 кг/га.
К несовершенным грибам относят ряд хорошо известных патогенов. К порядку гифомицеты, семейству монилиевые относят представители родов Metarhizium, Beauveria, Сephalosporium, Paecilomyces, Aspergillus. Среди представителей семейства стильбелловых известны виды рода Hirsutella.
Род Metarhizium характеризуются скученными конидиеносцами, в виде более или менее выраженного полисадного слоя, несут на вершине фиалиды и конидии. Фиалиды парные или собраны в мутовки. Конидии одноклеточные, яйцевидные, сидят на фиалидах цепочками, в массе обычно темно-зеленые. Metarhizium anisopliae – наиболее известный энтомопатогенный гриб, описанный более 100 лет назад как зеленый мускаридный гриб. Данный вид гриба экологически требует влажных теплых условий, поэтому он чаще всего встречается на насекомых, обитающих в почве. Болезнь обычна для личинок, куколок и взрослых особей хрущей и других жуков, гусениц совок, обитающих в почве, американской белой бабочки, а также и для некоторых вредителей запасов. Искусственно болезнь была перенесена на многих других насекомых.
Гриб можно культивировать на МПА или на микологическом агаре Дифко, однако лучше всего на твердых или жидких питательных средах с суслом. Из натуральных питательных сред можно использовать пивную барду, нарезанный стерилизованный картофель, морковь, свекла, прорастающие раздробленные зерна кукурузы. При глубинном культивировании развиваются яйцевидные споры, подобные спорам Beauveria bassiana.
На основе Metarhizium anisopliae были получены первые препараты биопестицидов в промышленных масштабах. Классическим примером практического использования этого гриба является его применение для борьбы с хлебным жуком Anisoplia austriaca. Личинки вредителя сосредоточиваются в большом количестве возле корней растений и поэтому легко заражаются препаратом гриба, применяемым при посеве или внесении удобрений. Погибшие от болезни особи становятся вторичными очагами инфекции, откуда болезнь распространяется далее.
Другим классическим объектом является свекловичный долгоносик. Теленга обрабатывал семена свеклы спорами гриба или вносил их вместе с удобрениями и добился 68-75% смертности личинок долгоносика. На прилегающих необработанных территориях смертность вредителя составляла 42%. Это свидетельствует о том, что почва являлась благоприятной средой для развития болезни.
Гриб Metarhizium anisopliae – космополит, распространен по всему миру и отсутствует лишь в некоторых изолированных местах (островах и т.п.). Поражает многие группы насекомых, включая слюнного пастбищного клопа и вредителя сахарного тростника. В сочетании с вирусом препарат данного гриба используют для контроля численности жука-носорога, являющегося главным вредителем пальм на островах в южной части Тихого океана. Есть данные о том, что с его помощью можно бороться с коричневой цикадой – вредителем риса.
Известен препарат Метаризин, используемый против почвенных стадий развития жуков – свекловичного и люцернового долгоносика, проволочников. Действие препарата наблюдается только через 30-50 дней при внесении в почву в дозе до 30 кг/га
Verticilium lecanii является единственным грибным энтомопатогеном, на основе которого на западе успешно выпускают препараты в промышленных масштабах. Его изучение началось в начале 80-х годов. Этот организм способен контролировать в оранжереях численность тлей и белокрылки в течение нескольких месяцев. Норма расходования препарата 17-70 кг/га, проводят 2-3 обработки через 10-12 дней.
Hirsutella thompsonii использовали некоторое время в США для производства препарата «Микар» с целью контроля численности цитрусовых клещей. Выпуск препарата, однако, был прекращен, так как он не оправдал надежд.
В США, Чехии, Австралии и на Кубе разработаны эффективные препараты на основе мускаридного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill для борьбы с вредителями различных сельскохозяйственных растений, для контроля популяции насекомых в почве. Для инфицирования саранчи в США используют австралийский микроскопический гриб Enthomophthora praxibuli. Саранча погибает в течение 7–10 дней после применения препарата. Споры гриба после зимовки в почве способны поражать следующие поколения насекомых. В Японии выпущен в продажу инсектицид на основе гриба Aspergillus для защиты лесов от вредителей; препарат вносят в почву, он поглощается корнями деревьев, распространяясь по сосудистой системе дерева, защищает его от насекомых.
Род боверия характеризуется особой формой и расположением конидиеносцев вдоль разветвленных септированных гиф белого или слегка окрашенного мицелия. Они расположены единично, парами друг против друга или чаще мутовчато, имеют бутылковидную форму – у основания расширены, к вершине вытянуты в виде тонкого зигзагообразного волокна. Конидии одноклеточные, шаровидные или яйцевидные. в культуре образует войлочную грибницу более плотной консистенции, чем у Beauveria bassiana, и на агаре Сабуро выделяет вино-красный пигмент. Чаще всего B. tenella паразитирует на личинках майского хруща.
Боверин является отечественным грибным препаратом, который изготавливают на основе конидиоспор Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. Препарат выпускают в виде порошка с титром 2–6 млрд. конидиоспор/г. Применяют также в комплексе с химическими препаратами (хлорофосом, фозалоном, севином) при уменьшение дозы последних в 10 раз от принятой нормы для индивидуального химического пестицида. Боверин почти так же эффективен, как лучшие из доступных химических пестицидов. После заражения насекомого B. bassiana выделяет боверицин, циклодепсипептид-токсин. Боверин безопасен для человека и теплокровных, не вызывает ожогов у растений.
3. Получение боверина возможно как экстенсивным поверхностным, так и более экономичным глубинным способом ферментации. Последний, однако, является достаточно трудной технико-технологической задачей. При глубинной ферментации гриб размножается вегетативно, образуя гифальные тельца (гонидии), которые по действию близки воздушным конидиям, но уступают им в устойчивости (в процессе распылительного высушивания до 90% гонидиоспор погибает). Конидиоспоры удается получать в глубинной культуре на основе оптимизированной питательной среды. При этом до 90 % выращенных клеток переходит в конидиоспоры достаточно высокой вирулентности. Культивирование гриба реализуется в строго стерильных условиях в глубинной культуре при 25–28°С в течение 3–4 суток. Питательная среда содержит (%): кормовые нелизированные дрожжи – 2, крахмал – 1, хлорид натрия – 0.2, хлорид марганца – 0.01, хлорид кальция – 0.05. Существенное значение имеет концентрация азота, так как его дефицит снижает скорость роста, а избыток – стимулирует образование гонидий. Оптимальная концентрация аминного азота составляет 10–15 мг %. Титр конидиоспор в культуре достигает 0.3–1.3 млрд./мл. Культуральную жидкость сепарируют с образованием пасты остаточной влажности 70–80 % и титром спор 8 млрд./г. Пасту высушивают распылительным способом до влажности 10 % и титра 8.109 клеток/г. В готовый препарат часто добавляют вещество-прилипатель и стабилизируют каолином.
Поверхностное культивирование гриба требует больших производственных площадей и более трудоемко, поэтому имеет меньшие масштабы. Способ реализуется в разных вариантах: на жидкой среде без соблюдения правил стерильности, аэрации и перемешивания; на твердой среде или жидкой среде в условиях асептики и комбинированным способом пленки. При твердофазной ферментации с использованием сусло-агара, картофеля, зерна пшеницы или кукурузы образование конидиоспор завершается на 12–15 сутки. На жидких средах образование спор наблюдается через 7–10 суток, а на 18–25 сутки сформированную спороносную пленку снимают. Полученный материал высушивают, размалывают и смешивают с тальком или торфом. Производительность метода – до 800 кг в месяц, титр – 1,5×109/г. Готовая форма препарата представляет собой сухой мелкодисперсный порошок конидиоспор, смешенный с каолином; титр – 1,5 млрд. конидий/г. Препарат эффективен против листогрызуших садовых вредителей, яблоневой плодожорки, вредителей леса, а также вредителя картофеля – личинок колорадского жука, вредителей растений защищенного грунта (тепличной белокрылки, табачного трипса). Используют боверин путем опрыскивания растений, норма расхода – 1–2 кг/га. В сочетании с небольшими добавками химических пестицидов препарат вызывает гибель 100 % личинок всех возрастов.
Таким образом, многочисленные виды энтомопатогенных грибов широко распространены в природе; они поражают широкий круг насекомых, обладая для этого различными механизмами, включая контактный, что облегчает их применение. Грибы хорошо сохраняются в виде спор и продуцируют разнообразные биологически активные вещества, усиливающие их патогенность. Однако грибные препараты не применяются пока достаточно широко. Это связано, во-первых, с определенными технологическими трудностями, возникающими при их культивировании и во-вторых, – обусловлено жесткими требованиями к факторам окружающей среды (высокая активность грибных препаратов проявляется только в условиях высокой и стабильной влажности). Для того чтобы применение грибных препаратов было эффективным, надо применять их в определенное время сезона и в оптимальной концентрации. Для этого необходимо знание этиологии грибных повреждений и как они взаимодействуют с насекомыми. Это обеспечит получение на основе грибов эффективных и достаточно экономичных пестицидов. В настоящее время, несмотря на имеющиеся ограничения, грибные препараты широко исследуются и начинают применяться для борьбы с вредителями.
Достижения последних лет свидетельствуют о принципиальной применимости методов генной инженерии для изучения физиологии, генетики и биохимии грибов. Это может привести к большему интересу к грибам как возможным продуцентам биопестицидов и, следовательно, к созданию более стойких и эффективных препаратов на их основе.