Работа №2 ПОЛУЧЕНИЕ ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЙ АПОБЕЛОК

Работа №2 ПОЛУЧЕНИЕ ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЙ АПОБЕЛОК

(3.04.2020)

1.Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?

Химические, биологические и физические.

Химические:

-обработка щелочью (дешево, изменение pH, после обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки);

-органическими растворителями (дешево и легко, применяют для выделения ферментов из дрожжей, но требуется дополнительные тестирования, чтобы продукт не денатурировал);

-детергентами (детергенты дороги, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт).

Биологические:

Лизис (гидролиз клеточных стенок)

-Грамположительных бактерий (лизоцимом яичного белка);

-Грамотрицательных бактерий (лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА));

-Дрожжей (одним или несколькими ферментами: β-1,3-глюканазы, β-1,6-глюканазы, манназы и хитиназы).

Ферментативная обработка (с применением рекомбинантных микроорганизмов для промышленного синтеза ферментов)

Физические

-немеханическими (например, с помощью осмотического шока или быстрого многократного замораживания и оттаивания), (но обычно многие клетки остаются неповрежденными);

-механическими (высокоэффективный метод)

• обработкой ультразвуком (клетки разрушаются под действием гидродинамических сил), (при малых объемах);

• с помощью шаровой мельницы (при больших объемах используют), (Большинство клеток разрушается под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков);

• гомогенизации под давлением (концентрированную клеточную суспензию продавливают через небольшое отверстие под высоким давлением, а затем давление резко сбрасывают, происходит лизис);

• соударения (клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность или навстречу потоку другой суспензии).

2.Какими растворами промывают “тельца включения” для подготовки к очистке? Для чего используется каждый этап промывки?

Разработали процедуру двухфазной жидкостной экстракции, позволяющую разделять растворимые и нерастворимые продукты.

Растворы:

а) 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

б) 0,9 % NaCl в 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

в) 0,1 % Triton-X-100 в 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

г) 5 мМ р-р СаСl2 в 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

д) 6 М мочевина, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 5 мМ CaCl2

Обрабатывают выделенные тельца включения денатурирующим буфером для солюбилизации, содержащим мочевину и L-аргинин. В результате обработки телец включения тиолами и мочевиной белок переводится в растворимое состояние, причем современные методики позволяют сделать этот процесс обратимым.

1. Расщепление слитого белка по остатку метионина с помощью CNBr

2. Получение S-сульфопроизводных

3. Восстановление S-сульфоцистеина до цистеина

4. Образование дисульфидных мостиков (O2, рН 10,6)

Отмывка 0.9% раствором NaCl служит для удаления гидрофильных примесей, 0.1% раствором Тритона Х-100 – для удаления гидрофобных компонентов (в основном, остатков клеточных мембран), 5 мМ CaCl₂ – для кальций-связывающих белков способствует образованию компактной структуры, что снижает их агрегацию.

3.Как приготовить 200 мл 7 % (v/v) раствора уксусной кислоты в воде из ледяной уксусной кислоты? (Сделать подробные расчеты)

Пусть ледяная уксусная кислота имеет 100% концентрацию.

Чтобы узнать необходимый объем уксуса можно использовать формулу:

V_уксуса=С_конц×V_{раствора}/С_{нач. конц}

Где:

С_кон – нудная нам концетрация готового раствора в %.

С_{нач. кон} – начальная(исходная) концентрация данного уксуса.

Решение:

V_уксуса=7×200/100=14(мл)

V_воды=200-14=186(мл)

Ответ:

Следует к 186 мл воды добавить 14 мл ледяной уксусной кислоты.

4.Как приготовить 100 мл 0.9% раствор NaCl в воде из стокового 1 М раствора NaCl, если его M_в=58 г/моль? (Сделать подробные расчеты)

n=m/M=0,9/58=0,02

V×1M=100мл×0,02=2мл

Ответ: Добавить 2мл поваренной соли к 98мл воды.

Ответ не верен. Для того, чтобы сделать требуемые расчеты, надо сначала привести концентрации к одним и тем же единицам. Можно использовать как молярную, так и процентную концентрацию. Возьмем для примера перевод в молярную концентрацию. Тогда 0.9% раствор NaCl в пересчете на моль/л (с использованием молекулярной массы) будет 0.155 моль/л. Это в 6.45 раз (1 моль/л : 0.155 моль/л = 6.45) меньше, чем концентрация NaCl в 1 М стоковом растворе. Чтобы узнать, сколько нужно взять стокового раствора, надо конечный объем требуемого раствора разделить на 6.45 (100 мл : 6.45 = 15.5 мл). Таким образом, для получения 100 мл 0.9% раствора NaCl следует взять 15.5 мл 1 М раствора NaCl и довести водой до 100 мл.

5. Как приготовить 300 мл 6М раствор мочевины в 20 мМ Трис-HCl pH 7.0, имея сухую мочевину и 1М Трис-HCl pH 7.0. М_в=60 г/моль. (Сделать подробные расчеты)

М=60г/моль (в 1 л раствора)

V_р-ра=300мл=0,3л

M_{мочивины в р-ре}=n×М=6×60г/моль=360г

360г – 1 л

Х – 0,3 л

Х=360×0,3=108 г

Для того, чтобы приготовить 300 мл 20 мМ раствора Трис-HCl pH 7.0 из 1 М стокового раствора, нужно взять 6 мл стокового раствора буфера и довести водой до 300 мл. Для приготовления 300 мл 6 М-го раствора мочевины понадобится около 250 мл 20 мМ-го раствора буфера, поскольку значительный объем занимает сама мочевина. Расчет количества мочевины верен.