Работа №1 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КЛОНИРОВАННЫХ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК E.coli

Работа №1 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КЛОНИРОВАННЫХ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК E.coli.

1.В какие отделы клетки и в какой форме может осуществляться экспрессия белка?

Накапливается либо в периплазме, либо в цитоплазме. При цитоплазматической экспрессии белок синтезируется неактивным или формирует агрегаты – тельца включения, то есть принимают кристаллизованную форму. Экспрессия белка в периплазматическое пространство и культуральную среду происходит в более растворимой форме, есть возможность избежать контаминации.

При цитоплазматической экспрессии белок не обязательно бывает в нерастворимой форме, существуют специальные приемы для экспрессии генов белков со сложным фолдингом, чтобы они оставались в растворимой форме – снижение температуры роста культуры и концентрации индуктора, создание слитых белков, одна часть которых обеспечивает повышенную растворимость, а потом отщепляется специфической протеазой (например, мальтозо-связывающий белок). Также в эукариотических экспрессионных системах при использовании лидерных пептидов экспрессия может осуществляться в клеточные органеллы (например, митохондриальная экспрессия).

2. Что такое рекомбинантные белки?

Это белок, кодируемый клонированной рекомбинантной ДНК. Данные белки получают с помощью генной инженерии.

3. Что такое “тельца включения”? Какие преимущества и недостатки они дают при выделении рекомбинантных белков?

Тельца включения – мелкие частицы из кристаллизовавшегося белка, образующегося в избыточном количестве в бактериальной клетке при заражении ее вирусом или при встраивании вирусного генома в ДНК клетки-хозяина. Их наличие свидетельствует о патологических изменениях в клетке.

Тельца включения – это не кристаллы, а нерастворимые агрегаты. Там нет упорядоченной кристаллической структуры. Преимущества накопления целевого белка в виде телец включения – стабильность (недоступность для протеаз), простота очистки и низкое содержание примесей. Недостатки – сложности с растворением и фолдингом.

4. В какие отделы клетки и в какой форме может осуществляться экспрессия белка? (одинаковый вопрос 1 и 4).

5. Назовите регуляторные участки, которые должны присутствовать в экспрессионной плазмиде.

Cайт инициации или ориджин репликации, промотор, сайт связывания рибосом, множественный клонирующий сайт (старт – кодон, целевой ген, стоп – кодон).

Также для селективного скрининга в экспрессионных плазмидах всегда присутствует ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотику.

6. Для чего нужна регуляция экспрессии белка и каким образом она осуществляется?

Регулировать экспрессию белка необходимо поскольку, экспрессия чужеродного белка может привести к гибели бактерии-хозяина, к тому же плазмиды могут утрачиваться после нескольких клеточных циклов. Эти проблемы можно решить путем контроля транскрипции таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе клеточного цикла и только в течение определенного времени.

Для этого используются сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E. соli; специально сконструированный tac-промотор, включающий — 10-область lас-промотора и — 35-область trp-промотора;промотор бактериофага λ; промотор гена 10 бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции генов. Так, lac-оперон в отсутствии лактозы находится в репрессируемом состоянии. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.

Ну и еще можно упомянуть арабинозный промотор, с которым мы, собственно, и работали.

7. Ген экспрессируемого в Е.coli белка находится под промотором РНК полимеразы фага Т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?

Промотор бактериофага Т7 является сильным промотором и обеспечивает очень высокий уровень транскрипции целевых генов. Для транскрипции гена под контролем Т7 необходима РНК полимераза бактериофага T7. Данный фермент очень активен и высокоспецифичен к последовательности промотора бактериофага T7. Транскрипция гена в плазмиде под управлением T7 промотора может быть запущена после синтеза T7 полимеразы ген, который встроенной в геном штамма-продуцента в виде профага (λDE3). Ген полимеразы, в свою очередь, может находиться под управлением индуцируемого промотора, такого как lac.T7 промоторы используются во многих коммерческих экспрессионных системах, таких как pET, pRSET, pCal и включается при добавлении ИПТГ.

8. Что такое ИПТГ? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?

ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид – индукторlac-оперона, который контролирует процесс транскрипции. В технологии рекомбинантных ДНК используется для индукции клонированных генов.

ИПТГ предотвращает связывание белка-репрессора с lac-опероном, что возобновляет транскрипцию, и как следствие запускает синтез нужного белка.

9. Как меняется оптическая плотность культуры в процессе роста клеток до и после индукции синтеза белка?

Индукция осуществляется на втором этапе культивирования бактерий, когда начинается активный синтез белка в большом количестве. На данном этапе оптическая плотность культуры может увеличиться только за счет увеличения телец включения и, следовательно, самой клетки, однако деления не происходит.После индукции оптическая плотность будет меняться значительно быстрее, чем до индукции. Это связано с началом экспрессии целевого белка.

Индукция осуществляется обычно в средней логарифмической фазе роста, когда оптическая плотность культуры достигает OD₆₀₀ ~ 0.6-0.7 оптических единиц. До индукции рост культуры экспоненциальный (плотность удваивается каждые 20-40 минут в зависимости от штамма). При добавлении индуктора ресурсы клетки затрачиваются на синтез белка, поэтому деление клеток замедляется и наблюдается снижение роста плотности до полного выхода на плато. Чем выше температура инкубации, тем более выражен этот эффект. Поэтому для штаммов с высокой продуктивностью инкубацию при 37 ^оС после индукции проводят в течение короткого времени, обычно не более 3 часов.