Лабораторные_Буракова

Работа №1 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КЛОНИРОВАННЫХ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК E.coli.

1. В какие отделы клетки и в какой форме может осуществляться экспрессия белка?

Накопление белка при экспресиии происходит либо во внутреннем пространстве клетки, в цитоплазме. При цитоплазматической экспрессии белок синтезируется неактивным или формирует агрегаты – тельца включения.

Экспрессия белка в периплазматическое пространство и культуральную среду проис одит в растворимой форме, имеется возможность избежать контаминации. В эукариотических экспрессионных системах при использовании пептидов.

Так же экспрессия иногда ос ществляется в органеллах (митохондриальная экспрессия)

3. Что такое “тельца включения”? Какие преимущества и недостатки они дают при выделении рекомбинантных белков?

Тельца включения – мелкие частицы агрегаты, образующегося в избыточном количестве в бактериальной клетке при заражении ее вирусом или при встраивании вирусного генома в ДНК клетки-хозяина.

Преимущества связаны с недоступностью данных белков к разрушению протеазами.

Недостатки – невозможность быстро уничтожить эти структуры, если они начинают мешать.

5. Назовите регуляторные участки, которые должны присутствовать в экспрессионной плазмиде.

Cайт инициации, промотор, сайт связывания рибосом, множественный клонирующий сайт (старт – кодон, целевой ген, стоп – кодон).

6. Для чего нужна регуляция экспрессии белка и каким образом она осуществляется?

Контролировать экспрессию белка необходимо поскольку, экспрессия чужеродного белка может привести к гибели бактерии-хозяина, к тому же плазмиды могут утрачиваться после нескольких клеточных циклов.

Эти проблемы можно решить путем контроля транскрипции таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе клеточного цикла и только в течение определенного времени.

Для этого используются сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E. соli; специально сконструированный tac-промотор, включающийних— 10-областьуйlас-промотора и — 35-область trp- промотора;промотор бактериофага λ; промотор гена 10 бактериофага Т7. С каждым из связываются соответств ющие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции генов.

Так, lac-оперон в отсутствии лактозы находится в репрессируемом состоянии. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.

7. Ген экспрессируемого в Е.coli белка находится под промотором РНК полимеразы фага Т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?

Промотор бактериофага Т7 является сильным промотором и обеспечивает очень высокий уровень транскрипции целевых генов. Для транскрипции гена под контролем Т7 необходима РНК полимераза бактериофага T7.

Данный фермент очень активен и высокоспецифичен к последовательности промотора бактериофага T7. Транскрипция гена в плазмиде под управлением T7 промотора может быть запущена после синтеза T7 полимеразы ген, который встроенной в геном штамма-продуцента в виде профага (λDE3).

Ген полимеразы, в свою очередь, может находиться под управлением индуцируемого промотора, такого как lac.T7 промоторы используются во многих коммерческих экспрессионных системах, таких как pET, pRSET, pCal и включается при добавлении ИПТГ.

8. Что такое ИПТГ? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?

ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид – индуктор lac-оперона, который контролирует процесс транскрипции. В технологии рекомбинантных ДНК используется для индукции клонированных генов.

ИПТГ предотвращает связывание белка-репрессора с lac-опероном, что возобновляет транскрипцию, и как следствие запускает синтез нужного белка.

9. Как меняется оптическая плотность культуры в процессе роста клеток до и после индукции синтеза белка?

Индукция происходит в фазу роста при культивировании бактерий, когда начинается активный синтез белка. На данном этапе оптическая плотность культуры может увеличиться только за счет увеличения телец включения и, следовательнохуй, самой клетки, однако деления не происходит. При добавлении индуктора рес рсы клетки затрачиваются на синтез белка, поэтому деление клеток замедляется и наблюдается снижение роста плотности до полного вы ода на плато.

Работа №2 ПОЛУЧЕНИЕ ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЙ АПОБЕЛОК

1.Какие методы используют для разр шения бактериальных клеток? Химические, биологические и физические.

Химические методы:

•обработка щелочью (дешево, изменение pH, после обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки);

•органическими растворителями (дешево и легко, применяют для выделения ферментов из дрожжей, но требуется дополнительные тестирования, чтобы продукт не денатурировал);

•детергентами (детергенты дороги, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт).

Биологические методы:

Лизис (гидролиз клеточных стенок)

•-Грамположительных бактерий (лизоцимом яичного белка);

•-Грамотрицательных бактерий (лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА));

•-Дрожжей (одним или несколькими ферментами: β-1,3-глюканазы, β- 1,6-глюканазы, манназы и хитиназы).

•Ферментативная обработка (с применением рекомбинантных микроорганизмов для промышленного синтеза ферментов)

Физические методы:

• -немеханическими (например, с помощью осмотического шока или

быстрого многократного замораживания и оттаивания), (но обычно

• гидродинамическихмногие клетки остаютсяунеповрежденнымибольшой); -механическими (высокоэффективный метод)

• обработкой ультразв ком (клетки разрушаются под действием сил), (при малых объемах);

• с помощью шаровой мельницы (при больших объемах используют), (Большинство клеток разр шается под де ствием сдвиговых напряжений, возникающих в рез льтате быстрого движения шариков);

• гомогенизации под давлением (концентрированную клеточную суспензию продавливают через небольшое отверстие под высоким давлением, а затем давление резко сбрасывают, происходит лизис);

• соударения (клеточн ю с спензию вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность или навстречу потоку другой суспензии).

2.Какими растворами промывают “тельца включения” для подготовки к очистке? Для чего используется каждый этап промывки?

Разработали процедуру двухфазной жидкостной экстракции, позволяющую разделять растворимые и нерастворимые продукты.

Растворы:

а) 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

б) 0,9 % NaCl в 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

в) 0,1 % Triton-X-100 в 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

г) 5 мМ р-р СаСl2 в 20 мМ Трис-HCl pH 7,0;

д) 6 М мочевина, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 5 мМ CaCl2

Обрабатывают выделенные тельца включения денатурирующим буфером для солюбилизации, содержащим мочевину и L-аргинин. В результате обработки телец включения тиолами и мочевиной белок переводится в растворимое состояние, причем современные методики позволяют сделать этот процесс обратимым.

1.Расщепление слитого белка по остатку метионина с помощью CNBr

2.Получение S-сульфопроизводных

3.Восстановление S-сульфоцистеина до цистеина

4.Образование дисульфидных мостиков (O2, рН 10,6)

3.Как приготовить 200 мл 7 % (v/v) раствора уксусной кислоты в воде из ледяной уксуснойхуйкислоты? (Сделать подробные расчеты)

Пусть ледяная уксусная кислота имеет 100% концентрацию.

Чтобы узнать необ одимый объем кс са можно использовать формулу:

Vуксуса=Сконц×Vраствора/Снач. конц

Где:

Скон – нудная нам концетрация готового раствора в %.

Снач. кон – начальная(ис одная) концентрация данного уксуса.

Решение:

Vуксуса=7×200/100=14(мл) Vводы=200-14=186(мл)

Ответ:

Следует к 186 мл воды добавить 14 мл ледяной уксусной кислоты.

4.Как приготовить 100 мл 0.9% раствор NaCl в воде из стокового 1 М раствора NaCl, если его Mв=58 г/моль? (Сделать подробные расчеты)

1)0.9% раствор NaCl будет эквивалентен - 0.155 моль/л.

2)1 моль/л : 0.155 моль/л = 6.45, раз его концентрация больше

3)100 мл : 6.45 = 15.5 мл – нужно добавить для приготовления раствора

Для получения 100 мл 0.9% раствора NaCl следует взять 15.5 мл 1 М раствора NaCl и добавить воды до 100 мл.

5. Как приготовить 300 мл 6М раствор мочевины в 20 мМ Трис-HCl pH 7.0, имея сухую мочевину и 1М Трис-HCl pH 7.0. Мв=60 г/моль. (Сделать подробные расчеты)

М=60г/моль (в 1 л раствора)

Vр-ра=300мл=0,3л

Mмочивины в р-ре=n×М=6×60г/моль=360г

360г – 1 л Х – 0,3 л

Х=360×0,3=108 г

Лабораторная работа №3 ИОНООБМЕННАЯ И ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ

1.Каков принцип разделения веществ с помощью ионообменной хроматографии?

Этот вариантвзаимодействияхроматографииклассифицируетсяйна два типа — катионную и анионную ионообменную хроматографию.

Ионообменная роматография позволяет разделить молекулы, основываясь

на ионных . Неподвижная фаза имеет заряженные

функциональные группы, которые взаимоде ствуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда.

2.Какие существуют виды хроматографии по механизму разделения веществ?

Распределительная, ионообменная, адсорбционная, эксклюзионная, аффинная, осадочная хроматография.

3.Каков принцип разделения веществ с помощью аффинной хроматографии?

Воснове лежит реакция взаимодействия разделяемых примесей с лигандом, связанным с инертным носителем.

Вроли примесей выступают биологически активные вещества (белки, ферменты), вступающие с лигандом в биохимическое взаимодействие. Например, антитело-антиген.

4.Каков принцип разделения веществ с помощью эксклюзионной хроматографии?

Молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы, способные проникать в минимальное

число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры.

5.Каков принцип разделения веществ с помощью тонкослойной хроматографии?

Метод основан на использовании тонкого слоя адсорбента в качестве неподвижной фазы. Разделяемые вещества по-разному распределяются между сорбирующим слоем и протекающим через него элюентом, вследствие чего расстояние, на которое эти вещества смещаются по слою за одно и то же время, различается.

6.Назовите основные блоки хроматографической системы.

Насос для подачи подвижной фазы (элюента) через колонку; дозатор для

введения пробы в колонку; разделительная (аналитическая) колонка; детекторхроматография- устройство для полуйчения аналитического сигнала, пропорционального концентрации определяемого компонента;

блок автоматики служит для преобразования аналитического сигнала в форму, необ одимую для автоматического управления и расчета концентрации искомого аналита.

7.Назовите виды роматографии с точки зрения агрегатного состояния фаз.

Газовая : газо-жидкостная; газо-твёрдофазная. Жидкостная хроматография:

жидкостно-жидкостная, жидкостно-твёрдофазная, жидкостно-гелевая.

8.Назовите виды хроматографии по способу локализации сорбента.

Колоночная (неподвижная фаза находится в колонке); плоскостная — бумажная и тонкослойная (неподвижная фаза — лист бумаги или тонкий слой сорбента на стеклянной или металлической пластинке); капиллярная (разделение происходит в плёнке жидкости или слое сорбента, размещённом на внутренней стенке трубки); хроматография в полях (электрических, магнитных, центробежных сил).

9.Для каких целей может использоваться хроматография?

Хроматография позволяет решать аналитические задачи (разделение, идентификация, определение) и препаративные (очистка, выделение, концентрирование).

В биотехнологии хроматография является основным процессом выделения вирусов гриппа, энцефалита, очистки вакцин, промышленного производства инсулина, других белков и полипептидов. На промышленную основу

хуй

Работа №5 АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ПО МЕТОДУ ЛЭММЛИ

1.Что такое электрофорез? Какие преимущества дает проведение электрофореза на твердых подложках?

Электрофорез – это процесс разделения веществ в электрическом поле в соответствии с их электрическим зарядом.

Электрофорез можно проводить в растворе и с использованием различных носителей: