Современные проблемы и методы биотехнологии

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

где Sп − площадь пика, см2; V − шкала самописца, мВ·cм–1; Fr − скорость газаносителя, мл·с–1; q − масса соединения, мг; F − скорость движения ленты самописца, см·с–1. Размерность чувствительности в этом случае – мВ·мг·мл–1.

Чувствительность потоковых детекторов (мВ·мг·с-1)

В последние годы чаще всего определяют предел детектирования. Для оценки минимально обнаруживаемой концентрации необходимо, кроме чувствительности, знать уровень флуктуаций (шума) нулевой линии. Минимальным сигналом, поддающимся измерению, обычно принято считать сигнал, высота которого в несколько раз (2–5) превышает уровень шумов d:

Величина сmin – предел детектирования – определяет предельные возможности прибора.

Под линейностью детекторов понимают диапазон концентраций, в пределах которых наблюдается линейность зависимости сигнал – концентрация. Для определения величины линейности строят соответствующий график. Обычно диапазон линейности расположен от предела детектирования до концентраций, в которых уже наблюдается отклонениеот линейности на 5–10 %.

Под инерционностью (быстродействием, постоянной времени) подразумевается скорость реагирования детектора на быстрое изменение концентрации на выходе из колонки. Детектор должен иметь такое быстродействие, чтобы при регистрации не искажать формы полосы соединения, выходящего из колонки. В современных, особенно ионизационных детекторах постоянная времени – менее 0,1–0,01 с. В некоторых катарометрах, чаще всего устаревших конструкций, постоянная времени может составлять около 1 с и даже выше.

Быстродействие сильно зависит от величины эффективного объема ячейки.

Уровень шума нулевого сигнала детектора определяется кратковременными флуктуациями. Дрейф – это монотонное смещение нулевой линии. Величину смещения оценивают в течение 1 часа. Обычно требования к этим показателям таковы: шум 0,5 % рабочей шкалы и дрейф не более 3 % в час.

Механизм работы детекторов

Пламенно ионизационный детектор (ПИД) основан на ионизации ор-

ганических соединений в пламени водорода. Точный механизм ионизации не выяснен. С использованием масс-спектрометрометрии проведено исследование и обнаружено, что механизм ионообразования связан с термодеструкцией и последующей хемоионизацией. В ПИД одним из электродов служит горелка, второй электрод − коллектор − располагается над горелкой. Малые то-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

ки (1·10–9–10–12 А) усиливаются, так как шумы самого детектора малы. Из-за высокой чувствительности, большого диапазона линейности ПИД стал наиболее распространенным детектором.

Детектор по теплопроводности (ДТП) − катарометр. Чувствительны-

ми элементами в ДТП являются нагретые нити (филаменты) из ряда металлов (платина, вольфрам, сплав вольфрам–рений и др.), помещенные в специальные камеры, продуваемые газом-носителем. Филаменты включены в плечи моста Уинстона. Через сравнительную камеру проходит поток чистого газаносителя, через рабочую камеру − газ-носитель с примесями разделяемых соединений. Сопротивление нитей зависит от температуры. При изменении состава газа в рабочей камере теплопроводность его изменяется, изменяется теплопередача от нити к стенкам камеры, температура нити и, следовательно, сопротивление нити по сравнению с сопротивлением нити в сравнительной камере. Происходит разбаланс моста, возникает сигнал на нулевой линии.

Электронно-захватный детектор (ЭЗД) предназначен для анализа ве-

ществ, обладающих электронным сродством, в частности галогенноорганических соединений. Полезный сигнал детектора− это уменьшение начального тока, однозначно связанного с количеством анализируемого соединения. В ионизационной камере ЭЗД помещается радиоактивный источник (например, 63Ni). Под воздействием радиации молекулы газа-носителя (азот, аргон, гелий) ионизируются с высвобождением электрона. В камере между электродами приложено напряжение, фоновый ток создается в основном электронами, так как их подвижность на три порядка выше, чем подвижность ионов. Кроме того, большая часть ионов рекомбинирует, не доходя до электродов. При попадании в ячейку детектора соединений, обладающих сродством по отношению к электрону, происходит захват ими свободных электронов, что приводит к снижению начального фонового тока. ЭЗД обладает высокой ионизационной эффективностью. В газе-носителе недопустимо присутствие кислорода, влаги и других соединений, снижающих количество электронов или их подвижность. Предел детектирования ЭЗД на два-три порядка ниже ПИД, он сильно зависит от числа и положения атомов галогенов в молекулах.

Термоионный детектор (ТИД) селективен к N- и P-содержащим соединениям за счет введения в пламя водорода паров солей щелочных металлов (К, Na, Rb и Cs). Скорость введения паров щелочных металлов должна быть стабилизирована. ТИД чувствителен к стабильности поддержания скорости водорода, воздуха и газа-носителя. Селективность ТИД к N- и P-органичес- ким соединениям по сравнению с ПИД − порядка102–103.

Пламенно-фотометрический детектор (ПФД) селективен к S- и P-содержащим соединениям, при сжигании которых в пламени, обогащенном водородом, по сравнению с ПИДом, излучаемый свет от этих элементов на-

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

правляется в фотоумножитель через специальные фильтры (394 нм для S

и526 нм для Р).

Вфотоионизационном детекторе (ФИД) ионизация анализируемых соединений происходит за счет УФ-излучения в специальной камере с двумя электродами. При фотоионизации молекулы анализируемых соединений диссоциируются на ион и электрон. Образуемые ионы собираются электродами. Ионизируются только те соединения, потенциал которых ниже энергии фотонов. В зависимости от лампы, энергия фотонов может быть 9,5; 10,2 и 11,7 эВ.ФИД, как и ПИД, обладает высокой чувствительностью ко всем органическим соединениям. К ароматическим соединениям ФИД имеет в 10–50 раз большую чувствительность, чем ПИД. В отличие от ПИД, ФИД может регистрировать

H2S, PH3, NH3, AsH3.

Масс-спектрометрический детектор (МСД). В последние годы дос-

тигнут прогресс в создании небольших настольных МСД для газовых хроматографов. В настоящее время этот высокочувствительный детектор− самый совершенный прибор для идентификации неизвестных веществ.

Колонки для газовых хроматографов подразделяются на насадочные

(НК): препаративные, аналитические, микронасадочные и капиллярные (КК). В насадочных, микронасадочных колонках сорбент находится внутри трубки и имеет форму цилиндра. Набивка должна быть плотной и однородной, без пустот. Чем плотнее и однороднее набивка, тем меньше размывание полос и больше эффективность колонки. В КК слой сорбентов наносится на внутреннюю поверхность капилляра в виде слоя жидкой неподвижной фазы или в виде слоя адсорбента. Технология капиллярных колонок и хроматографического оборудования в целом находится в постоянном развитии.

Разработка программного обеспечения и совершенствование хроматографического оборудования существенно расширили область применения газовой хроматографии в науке и промышленности. Имеющаяся в Сибирском Федеральном университете аналитическая приборная база позволяет решать ряд биотехнологических задач. Например, поиск углеводородсинтезирующих штаммов среди одноклеточных водорослей показал принципиальное отличие состава углеводородов природного штамма Botryococcus, выделенного из озера Шира, и музейного Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252, полученный из коллекции культур одноклеточных водорослей Института физиологии растений РАН (IPPAS). На рис. 6.10 представлена хроматограмма углеводородов музейного штамма, выделенных из биомассы водорослей и гидрированных для идентификации наличия ненасыщенных связей. Углеводороды, синтезируемые природным Botryococcus, принципиально отличаются от музейного штамма и представлены диенами и триенами с числом атомов углерода от 23 до 29 .

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

а

б

Рис. 6.10. Ионная хроматограмма углеводородов музейного штамма Botryococcus braunii

Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252: а – исходный образец; б – после гидрирования [3, 22]

Не менее интересным для биотехнологии представляют ацетиленовые кислоты, характеризующиеся противовоспалительным эффектом. Источником таких кислот может быть водный мох Fontinalis antipyretica, обильно покрывающий дно реки Енисей. Типичная хроматограмма жирных кислот, содержание которых в биомассе может достигать 15–20 % , представлена на рис. 6.11.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Рис. 6.11. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Fontinalis antipyretica. Первая цифра – число атомов углерода в цепи жирных кислот, вторая – число насыщенных связей, третья – положение первой двойной связи с метильного конца.

А1 – 6a, 9, 12–18:3; А2 – 6a, 9, 12, 15–18:4; А5 – 8a, 11, 14–20:3; А7 – 8а, 11, 14, 17–20:4 [12]

Рис. 6.12. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Ralstonia еutrophа В5786 до и после гидрирования. Первая цифра – число атомов углерода в цепи жирных кислот, вторая – число насыщенных связей, третья – положение первой двойной связи с метильного конца [11]

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Как видно, доля ацетиленовых кислот в спектре жирных кислот состав ляет более 40 %.

Рис. 6.13. Ионные хроматограммы полигидроксиалканоатов, синтезируемыеRalstonia eutrophа; С4 – β-гидроксибутирата; С5 – β-гидроксивалерата; С6 – β-гидроксигексаноата [4, 5]

Бактерии Ralstonia eutrophа относятся к наиболее перспективным продуцентам биотехнологичекого продукта− полигидроксиалканоатов (ПГА). Они синтезирует с высокими выходами полимеры (до 80–90 %) различной химической структуры на различных субстратах. Технология выделения полимеров предусматривает использование растворителей, которые хорошо экстрагируют из клеток и липидные компоненты, поэтому основными загрязнениями промышленных образцов ПГА могут быть соединения липидной природы. Для того чтобы прогнозировать источник примесей в полимере, был изучен состава жирных кислот в биомассе водородных бактерий с помощью хромато-масс-спектрометрии. Кроме того, для идентификации жирных кислот были использованы методы химической модификации жирных кислот – гидрирование и сравнение хроматограмм до и после гидрирования метиловых эфиров жирных кислот. Результаты проведенных исследований показаны на рис. 6.12.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Метод газовой хроматографии используется и для качественного и количественного анализа полимера. Количественный анализ полимера проводится с внутренним стандартом, в качестве которого используется бензойная кислота. Качественный анализ позволяет выявить мономерный состав полигидроксиалканоатов. Нарис. 6.13представлена серия хроматограмм полимеров с разным соотношением мономеров – β-гидроксибутирата, β-гидроксивалерата и β-гидроксигексаноата.

6.2.4. Высокоэффективная жидкостнаяхроматография

ВЭЖХ – это жидкостная колоночная хроматография, механизмы сорбции в которой могут использоваться самые различные. По существу, ВЭЖХ − это современная форма реализации классической жидкостной колоночной хроматографии. Ниже перечислены некоторые наиболее существенные качественные характеристики ВЭЖК:

–высокая скорость процесса, позволившая сократить продолжительность разделения от нескольких часов и суток до минут;

–минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции;

–высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография достигла нового уровня воспроизводимости и точности.

Интенсивные исследования последних десятилетий, громадный объем накопленных экспериментальных данных позволяют сегодня уже говорить о классификации вариантов в рамках метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Конечно, при этом остается в силе классификация по механизму сорбции, приведенная выше. Распространена классификация, основанная на сравнительной полярности подвижной и неподвижной фаз. При этом различают нормально- и обращенно-фазовую хроматографию.

Нормально-фазовая хроматография (НФХ) − такой вариант ВЭЖХ,

когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, и есть основания считать, что основной фактор, определяющий удерживание, − это взаимодействие сорбатов непосредственно с поверхностью либо объемом сорбента.

Обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) − такой вариант ВЭЖХ,

когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента; при этом ионизированные сорбаты не обмениваются на ионы подвижной фазы, сорбированные на поверхности.

Ионообменная хроматография − вариант, при котором сорбция осуществляется путем обмена сорбированных ионов подвижной фазы на ионы хроматографируемых веществ; полностью аналогично можно определить лигандообменную хроматографию.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Хроматография на динамически модифицированных сорбентах − ва-

риант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с поверхностью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами приповерхностных слоев элюента.

Ион-парная хроматография − такой вариант обращенно-фазовой хроматографии ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу добавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбционные характеристики системы.

Эксклюзионная хроматография − способ разделения соединений по их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров.

Для ВЭЖК очень важной характеристикой является величина сорбентов, обычно 3–5 мкм, сейчас до 1,8 мкм. Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы. Компоненты пробы, введенной в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени. Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок, можно управлять степенью разделения анализируемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки.

Сорбенты. Становление ВЭЖХ в значительной мере связано с созданием новых поколений сорбентов с хорошими кинетическими свойствами и разнообразными термодинамическими свойствами. Основной материал для сорбентов в ВЭЖХ− силикагель. Он механически прочен, обладает знач и- тельной пористостью, что дает большую обменную емкость при небольших размерах колонки. Наиболее ходовой размер частиц 5–10 мкм. Чем ближе к шарообразной форма частиц, тем меньше сопротивление потоку, выше эффективность, особенно, если отсеяна очень узкая фракция (например, 7 + 1 мкм). Удельная поверхность силикагеля 10–600 м2/г. Силикагель может быть модифицирован различными химическими группами, привитыми к поверхности (С-18, CN, NH2, SO3H), что позволяет использовать сорбенты на его основе для разделения самых различных классов соединений. Основной недостаток силикагеля − малая химическая стойкость при рН < 2 и рН > 9 (кремнезем растворяется в щелочах и кислотах). Поэтому в настоящее время идет интенсивный поиск сорбентов на базе полимеров, стойких при рН от 1 до 14, например, на основе полиметилметакрилата, полистирола и т.д.

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

Сорбенты для ионообменной хроматографии. В силу особенностей разделения (в кислой или щелочной среде) основной материал сорбентов− полистирол с дивинилбензолом различной степени сшивки с привитыми к их поверхности группами SO3 -H+ (сильнокислые катионообменники) или -СОО-Na+ (слабокислые катионообменники), -Н2N+(CH3)3Cl- (сильноосновные анионообменники) или -N+HR2Cl- (слабоосновные анионообменники).

Сорбенты для гель-проникающей хроматографии. Основной тип − сти- рол-ДВБ. Используются также макропористые стекла, метилметакрилат, силикагель. Для ионо-эксклюзионной хроматографии используются те же сорбенты.

Насосы. Для обеспечения расхода подвижной фазы (ПФ) через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления. К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ЖХ относятся: диапазон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульсаций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоянного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления. По принципу действия насосы делятся на шприцевые и на плунжерные возвратно поступательные.

Шприцевые насосы. Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы. Недостатки насоса: а) большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя; б) приостановка разделения во время заполнения насоса; в) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (ну-

жен мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

Плунжерные возвратно-поступательные насосы. Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300–500 атм, расход 0,01–10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи – 0,5 %. Основной недостаток− растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давления и потока. Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического. Способы борьбы с пульсациями: с использованием сдвоенных насосов или двухплунжерного насоса Баглая, применением демпфирующих устройств и электронных устройств.

Величина объемной подачи определяется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3,13; 5,0; 7,0 мм), его амплитудой (12–18 мм) и частотой (что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Дозаторы. Назначение дозатора заключается в переносе пробы, находящейся при атмосферном давлении, на вход колонки, находящейся при давлении вплоть до нескольких атмосфер. Важно, чтобы в дозаторе отсутствовали непромываемые подвижной фазой «мертвые» объемы и размывание пробы в ходе дозирования. На первых порах дозаторы в ЖХ были аналогичны

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.2. Газожидкостнаяи высокоэффективная жидкостнаяхроматография для опр-я кол-ых и кач-ххаракт-кцелевых прод-в биотехнологии

газовым с проколом мембраны. Однако более 50–100 атм мембраны не держат, химическая стойкость их недостаточна, их кусочки загрязняют фильтры колонок и капилляры.

В жидкой фазе гораздо меньше скорости диффузии, чем в газовой. Поэтому можно дозировать с остановкой потока− проба не успевает размыться в дозаторе. На время ввода в дозатор пробы специальный кран перекрывает поток растворителя. Давление на входе в колонку быстро снижается, через несколько секунд пробу можно вводить в камеру дозатора обычным микрошприцем. Далее дозатор запирается, включается поток растворителя, идет разделение. Давление, которое держит этот кран, до 500–800 атм. Но при остановке потока нарушается равновесие в колонке, что может приводить к появлению «вакантных» дополнительных пиков.

Наибольшее распространение получили петлевые дозаторы. При заполнении дозатора под высоким давлением оказываются входы 1,2 и канал между ними. Входы 3–6, каналы между ними и дозирующая петля оказываются под атмосферным давлением, что позволяет заполнить петлю с помощью шприца или насоса. При повороте дозатора поток подвижной фазы вытесняет пробу в колонку. Для снижения погрешности петля промывается 5–10-кратным объемом пробы. Если пробы мало, то ее можно ввести в петлю микрошприцем. Объем петли обычно 5–50 мкл.

Колонки. Успех ВЭЖХ обусловлен не только созданием сорбентов, но и колонок, учитывающих особенности процесса разделения в ЖХ. Наиболее важны 2 момента: 1) создание максимально однородного слоя сорбента в цилиндрической трубке; 2) сведение к минимуму мертвых объемов в колонке и соединительных трубках.

Аналитическая колонка представляет собой трубку из нержавеющей стали, титана или стекла, заполненную сорбентом и закрытую с обеих сторон фильтрами для предотвращения высыпания сорбента. Фильтры имеют диаметр пор 2–5 мкм, что не создает сопротивления потоку.

Для получения высокой эффективности колонок необходимо соблюдение некоторых условий:

1.Внутренняя поверхность колонки должна быть зеркально гладкой;

2.Сорбент должен иметь однородную фракцию (5 + 1 мкм);

3.Переход от большого диаметра колонки к малому диаметру штуцера должен быть плавный, т.е. нужна конусная выточка в корпусе штуцера.

4.Стенка колонки должна быть достаточно прочной, чтобы выдержать давление 300–500 атм.

5.Между торцом колонки и фильтром не должно быть мертвого объема (воздушного зазора), что очень трудно обеспечить в соединениях типа «свагелок».

Учитывая уникальные свойства сорбентов, сложную конструкцию колонок, тщательность набивки колонок и их тестирование, стоимость колонок составляет 1 000–1 500 дол. США (отечественные колонки 1 млн руб.). Поэтому крайне желательно беречь колонки, предохранять от загрязнений с помощью предколонок, заполненных тем же сорбентом, но длиной 30–70 мм.