Микробиология

81

лать одной пипеткой, но при этом следует начинать с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0.5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до4350°С агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри(рис. 8). Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду не разливают по пробиркам, а поступают следующим образом. По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой 2в-4 чашки Петри. Затем заливают чашки 15-20 мл расплавленной и остуженной до48-50°С плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет, чашки Петри помещают в термостат.

Рис.6 - Схема приготовления разведений и посева суспензии микроорганизмов глубинным способом

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином.

Подсчет выросших колоний: Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей - через 5-7, колонки актиномицетов - через 7- 15 суток инкубации в термостатах.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию на -на

82

ружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Удобны для подсчета автоматические счетчики, срабатывающие на контакт ручного зонда с колонией. Недостатком этих счетчиков является необходимость повреждения колоний зондом. Существуют и другие счетчики, лишенные данного недостатка (рис.7).

Рис.7 - Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов

Для подсчета числа колоний чашку Петри крышкой вниз помешают на специальный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают число колоний пером с пружинным острием (2). Острием пера касаются дна чашки Петри в участке/ соответствующем положению колонии, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкает цепь, и показание счетчика (3) увеличивается на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, а цепь размыкается.

Лучшим следует считать то разведение, при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от30-50 до 100-150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата (М) вычисляют по формуле:

М = а ×10n

V

где: а – среднее число колоний при высеве из данного разведения; 10 – коэффициент разведения;

n - порядковый номер разведения, ив которого сделан высев; V - объем суспензии, взятый для посева (мл).

83

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

В зарубежной литературе этот метод получил название метода наиболее вероятного числа (most probable number) или сокращенно MPN. Метод основан на известном принципе альтернативного ответа "все или ничего". Для его осуществления из исследуемого материала готовят ряд последовательных разведений (рис. 8). Затем определенным объемом(обычно 1 мл) каждого разведения зазевают пробирки с жидкой прозрачной питательной средой, причем каждое разведение высевают в 3-5 параллельных пробирок. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от3 до 10 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, гага или накопление в среде продуктов метаболизма.

Таблица 1 - Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии (по Мак-Креди)

84

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рассчитывают по таблице Мак-Креди (табл.1), разработанной на основании метода вариационной статистики.

Рис.8. Схема определения количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Для этого первоначально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том по-

86

Рис.10 - Схема микрокультурального метода по Имшенецкому

87

Лабораторная работа № 2.4.

Методы получения накопительных и чистых культур микроорганизмов. Культуральные свойства микроорганизмов при выращивании

на жидких и плотных питательных средах

1.Общие сведения

Вусловиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются крайне редко. В то же время основная часть современных представлений об их свойствах, а также о взаимоотношении с представителями других групп организмов получена при изучении чистых культур. Поэтому часто возникает необходимость выделить чистые культуры различных видов микроорганизмов из объектов внешней среды, - когда они тесно сосуществуют в естественных условиях с микробами других видов, родов, семейств, групп и отделов.

Микробиологи для этих целей используют в качестве одного из основных

-метод накопительных культур. Накопительными называются культуры, в которых преобладает одна группа или даже один вид микроорганизмов. Накопление представляет собой основной этап процесса, который в конечном итоге позволяет получить чистые культуры. Оно также дает возможность оценить различные воздействия факторов окружающей среды на смешанную микробную популяцию, благодаря которым может происходить отбор микроорганизмов, способных взаимодействовать со специфическими субстратами или способных -хо рошо расти в необычных условиях. Для получения накопительных культур создают элективные условия, обеспечивающие преимущественное развитие лишь данной группы или данного вида микроорганизмов и неблагоприятные для развития сопутствующих форм микробов смешанной популяции.

Чистую культуру микроорганизма легко выделить, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой пропорции или даже преобладает количественно над другими видами, составляющими биоценоз смешанной популяции. Разработанные и используемые в микробиологии методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества особей данного организма за счет создания лучших (элективных, избирательных) условий для их роста и выживания по сравнениюс другими или путем пространственного отделения одного ив микроорганизмов от других членов популяции. Элективные условия предусматривают ряд факторов, влияющих на жизнедеятельность микроорганизма, например: его потребность в определенном питательном субстрате, отношение к кислороду, кислотности среды, температуре выращивания, способности к образованию спор и т.д. О развитии накопительной культуры судят визуально по характерным признакам изменения питательной среды, образованию пленки, выделению пигмента, появлению мути, возникновению пузырьков газа, а также по микроскопии микроорганизма на прижизненных и постоянных микробиологических препаратах.

На основе накопительных культур далее выделяют чистые культуры микроорганизмов.

Получение накопительных культур различных таксономических групп проводят при использовании физических, химических и биологических методов.

88

К физическим методам, которые могут быть использованы для получения накопительных культур, следует отнести: регуляцию роста температурой, тепловое одномоментное воздействие, ультразвуковую обработку и ультрафиолетовое облучение, приводящих избирательно к гибели или подавлению роста других микроорганизмов, присутствующих в популяции. Можно также использовать преимущества изучаемого микроорганизма в некоторых физических свойствах, таких, как его размеры и подвижность.

В химических методахиспользуют токсичные вещества, антибиотики, химиопрепараты, которые подавляют рост или убивают большинство микробов, находящихся в исследуемой популяции, не оказывая существенного влияния на выделяемый микроорганизм.

Биологические методы включают использование специфических чувствительных хозяев (животных), которые служат биофильтром для всей исследуемой популяции микроорганизмов. Данный способ используют в большей степени при работе с патогенными микроорганизмами, которые за счет своих свойств (инвазивность, токсигенность и др.) получают преимущества при развитии в организме чувствительных животных.

Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления используют сочетания физических, химических и биологических методов.

Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т.е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических(стационарных) условиях в колбах или пробирках, где концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно меняется в процессе их роста. Для получения накопительных культур также используются открытые системы. Например, с помощью хемостата можно обеспечить постоянство окружающей среды для бактерий, непрерывно подавая питательные вещества в концентрации, лимитирующей рост, и удаляя продукты метаболизма. Изменяя скорость разбавления среды в хемостате, можно контролировать концентрацию питательных веществ, лимитирующих рост. В свою очередь это может избирательно влиять на скорость роста различных микроорганизмов в смешанной культуре, в результате чего один из микроорганизмов смешанной популяции начинает количественно преобладать.

Из накопительных культур бактерии обычно выделяют путем их отделения на плотных питательных средах, используя специальные методы рассева (например, по способу Дригальского). Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося исследуемую культуру из пробирки в пробирку с питательной средой. Обычно используют пятикратные или десятикратные разведения.

2. Содержание лабораторного занятия Цели занятия:

-познакомиться с основными физическими, химическими и биологическими методами получения накопительных культур;

-практически освоить метод получения накопительной культуры картофельной палочки;

89

-практически освоить метод получения накопительной культуры сенной палочки;

-рассмотреть схемы и условия получения накопительных культур хемогетеротрофных и хемоавтотрофных бактерий, а также фотосинтезирующих микроорганизмов.

Материалы и оборудование

Чашки Петри, пробирки, конические колбы, мел, вата, электрические плитки, фильтровальная бумага, дистиллированная вода, автоклав, термостат.

Иллюстративный материал: схемы "Основные факторы, определяющие получение накопительных культур фотосинтезирующих микроорганизмов", "Основные факторы, существенные для получения накопительных культур хемоавтотрофных и хемогетеротрофных бактерий в синтетических средах".

Ход работы

Получение накопительной культуры картофельной палочки

(Bacillus subtilis var mesenterikus)

Промытые клубни картофеля, не очищая, нарезают кружочками. Поверхность их натирают мелом для нейтрализации среды и помещают в чашки Петри на двойной слой фильтровальной бумаги, смоченный дистиллированной водой. Чашки с картофельной средой выдерживают в автоклаве при 0.5 атм в течение 10 минут и ставят в термостат с температурой 27-30°С на 3-4 суток. На поверхности ломтиков картофеля образуется плотная морщинистая пленка культуры картофельной палочки. Окраска пленки может быть равной: беловато-серой, розовой, желто-бурой, черной, что зависит от разновидности культуры, получившей преимущественное развитие.

Получение накопительной культуры сенной палочки (Bacillus subtilis)

Конические колбы на 100-150 мл заранее "проваривают", кипятя в них воду 15-20 минут. Сено ив разнотравья мелко нарезают и помещают в колбу объемом 500 мл, заполняя ее на 1/4 объема, добавляют щепотку мела и кипятят ±5-20 минут, пока среда не приобретает цвет настоя крепкого чая. Сенной отвар заливают в подготовленные конические колбы сдоем1.0-1.5 см, закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 22-26°С или вблизи радиатора центрального отопления. Через двое суток на поверхности среды развивается беловатая пленка Bacillus subtilis, которая при старении - на 3-4 сутки - становится серовато-зеленой. Другие организмы при этом вырастают редко и в небольших количествах.

Обогащение и получение накопительных культур отдельных видов бактерии

Любая среда, подходящая для роста какого-то определенного организма, будет для него в некоторой степениселективной. Если смешанную популяцию микробов внести в жидкую селективную среду, то различные микроорганизмы будут конкурировать друг с другом за питательную среду. Поэтому в жидких на-

90

копительных культурах из всех членов внесенной популяции, способных расти в данных условиях, постепенно отбираются те, которые растут с наибольшей скоростью.

Селективность накопительной культуры определяется не только химическим составом среды. Получаемый в данной среде результат обогащения может существенно изменяться в зависимости от таких факторов, как температура, рН, ионная сила, освещенность, аэрация или источник инокулята. Например, для роста или накопления энтеробактерий, относящихся к родам Eschesichia и Enterobacter, можно использовать синтетическую среду, которая содержит: на 1 л дистиллированной воды - 1 г К2НРО4, 200 мг MgSО4×7H2О, 10 мг FeSО4×7H2О, 10 мг CaCl2, по 0.02-0.5 мг Mn, Mo, Co, Cu, Zn в виде неорганических солей (микроэлементы), 1 г NH4C1, 5 г глюкозы. Если среда стерилизуется в автоклаве, то глюкозу следует стерилизовать отдельно и затем стерильно добавлять в среду, т.к. в присутствии других ингредиентов среды, особенно фосфатов, сахара частично разлагаются и образуются вещества, весьма токсичные для ряда микроорганизмов. Представители рода Escherichia (в частности, и кишечная палочка) приспособлены к росту при несколько более высоких температурах, чем штаммы Enterobacter, т.к. первые являются обычными обитателями кишечного тракта теплокровных животных, а вторые живут в почве. Кроме того, представители эшерихий менее чувствительны к токсическому воздействию желчных солей. Таким образом, если повысить температуру инкубации до 45°С и добавить желчные со-

ли, то вышеописанная среда будет селективной для получения накопительной культуры бактерий рода Escherichia.

Селекцию с помощью температуры можно весьма успешно использовать также и для выделения цианобактерий, которые по типу питания и метаболизму очень сходны с многими водорослями. И водоросли, и цианобактерий могут расти в простой минеральной среде на свету при25°С. Однако развитие водорослей можно почти полностью исключить, если проводить инкубацию при35°С, т.к. температурный оптимум для водорослей, как правило, ниже, чем для цианобактерий. В ряде случаев накопительная среда может не обладать высокой селективностью в момент посева смешанной культуры, однако ее селективность для одного из микроорганизмов может резко возрастать в результате тех химических -из менений, которые вызывает этот организм при своем росте. Например, бактерии и дрожжи, осуществляющие брожение, обычно менее чувствительны к образуемым ими ив углеводов органическим конечным продуктам, чем другие микроорганизмы. Поэтому их развитие в богатой углеводами среде будет подавлять рост конкурирующих микроорганизмов.

При выделении спорообразующих бактерий(роды Bacillus и Clostridium) можно полностью исключить конкуренцию со стороны видов, необразующих спор, если предварительно обработать надлежащим образом инокулят. Пастеризация инокулята, т.е. кратковременный прогрев при высокой температуре(2-5 минут при 80°С), уничтожит все вегетативные клетки, но не убьет гораздо более устойчивой споры.