Mtdbthn4

- кинетин (6- фурфуриламинопурин)

Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК и РНК и белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

Цитокинины в составе сред включают для стимуляции клеточного деления в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов, при регенерации проростков из соматических эмбриондов или стеблевых почек.

При культивировании протопластов в составе культурных сред используют и абсцизовую кислоту. Абсцизовая кислота оказывает противодействие ауксинам, гиббереллинам и цитокининам.

Гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Важное свойство гиббереллинов – вызывать вытягивание стебля у розеточных растений или у растений с укороченным стеблем, т.е. устранять физиологическую и генетическую карликовость.

Гиббереллины относят к условно половым гормонам; например, у тыквенных они способствуют образованию мужских цветков.

Для гиббереллинов доказано их непосредственное действие на биосинтез ферментов, например, α-амилазы и других гидролаз в прорастающих семенах злаков; эти ферменты расщепляют крахмал до простых сахаров, которые усваиваются развивающимся зародышем.

23

Гиббереллины обнаружены у сумчатого гриба (аскомицета) Gibberella fujikuroi, а также в тканях высших растений.

Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиббереллановым скелетом из 19-20 С-атомов.

Для практических целей наиболее часто используют гибберелловую кислоту, которая производится в промышленности.

Обработка гибберелловой кислотой семян и клубней приводит к снятию у них покоя и стимулирует быстрое прорастание. Ее действие на озимые злаки заменяет яровизацию, необходимую для таких растений.

Всоставе культуральных сред используют гибберелловую кислоту для поддержания роста суспензионных культур, а также для индукции побегообразования.

-гибберелловая кислота

Внастоящее время известно большое число различных по составу питательных сред (табл.2). Среда Mypacсиге и Скуга – самая универсальная. Она пригодна для образования и роста каллусов, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так изменение соотношения ауксина и кинетина приводит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых культур (преобладание кинетина). Среда Ганборга и Эвелега подходит для культивирования клетокк и тканей бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для индукции андрогенеза в культуре пыльников. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или

24

ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

Таблица 2

Состав питательных сред, применяемых при культивировании клеток и тканей (по Р.Г.Бутенко, 1999)

2.3. Влияние физических факторов.

На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы – свет, температура, аэрация, влажность.

Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процесс вторичного синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и её физиологические особенности влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавонолевых гликозидов образуются в культурах клеток петрушки после освещения её непрерывным люминесцентным светом «холодный белый».

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26°С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфогенеза требует более низких температур

(18-20°С).

Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должны составлять 60-70%.

2.4. Методы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ.

В качестве источника БАВ используют каллусную ткань, которую получают твердофазным способом культивирования и глубинным суспензионным культивированием, осуществленным в периодическом и непрерывном (проточном) режимах (Чуегов и др., 2003).

2.4.1. Твердофазный способ культивирования.

Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в питательную среду (пробирки, колбы, чашки Петри). Соблюдают строгую стерильность.

Чтобы обеспечить развитие каллусных клеток в питательных средах (табл. 2), содержащих необходимые для роста вещества, клетки тканей, запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других тканей должны терять способность дифференцировки. Недифференцированному развитию клеток способствует прединкубация эксплантов на среде без гормонов в течение 3-6 суток.

Через 4-6 недели культивирования трансплантанта возникает первичный каллус, который необходимо перенести на свежую питательную среду. При культивировании на агаризованных средах кусочек каллуса должен иметь массу 60-100 мг на 30-40 мл свежей среды. Каллусная ткань, вырасшая на поверхности твердой питательной среды, имеет аморфную структуру, представляющую собой массу тонкостенных пареахимных клеток. Химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующего органа растения.

Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для данного растения цикл развития, т.е. начинается дифференциация. Этот процесс регулируют гормоны.

2.4.2. Глубинное суспензионное культивирование.

Для глубинного культивирования и получения суспензионных культур необходимо использовать линии клеток, образующих

27

небольшие агрегаты (по 5-10 клеток). Более пригодна каллусная ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при перемешивании её в нере….. жидкую среду. Трансплантат желательно обрабатывать пектиназой. Рекомендуется использовать среды, содержащие 2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы Ca. При подборе среды культивирования важно из среды исключить цитокинины или снижать их концентрацию, а концентрацию ауксинов увеличивать.

Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два слоя марли или через сита (нейлоновые, металлические), чтобы отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплантата. На образование клеточных агрегатов также сказывает влияние интенсивность перемешивания среды, так как клетки чрезвычайно чувствительны и быстро лизируются. Большинство клеток погибает.

Суспензионные культуры, как правило, состоят из отдельных клеток, варьирующих по форме и размеру, и неоднородных многоклеточных агрегатов. Соотношение отдельных клеток и таких агрегатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения

иусловий культивирования.

Впроцессе культивирования активно делящиеся клетки не только поглощают питательные вещества, но и выделяют продук-

ты собственной жизнедеятельности, в том числе и ферменты: α- амилаза, фосфогидролаза и др. они изменяют дисперсность суспензии. Повышать дисперсность суспензионных культур можно добавлением в среду низких концентраций пектиназы и целлюлозы. При управлении процессом выращивания клеток важно иметь гомогенную систему.

Глубинное культивирование можно осуществлять в колбах на качалках при частоте вращения 100-120 об/мин. На 60-100 мл среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани, чтобы начальная плотность клеточной популяции составила 0,5 105 – 2,5 105 клеток/мл среды. Сосуды с суспензией закрепляют на платформе тей-

28

кера или устанавливают на качалки ротационного типа. В этих условиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты. В лабораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100-250 мл с небольшим объемом питательной среды.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганизмов. Время их удвоения 1-3сут. Процесс культивирования растительных клеток занимает 2-3 нед., что повышает требования к обеспечению асептических условий.

При выполнении работ с использованием культуры клеточных суспензий необходимо знать их основные параметры.

Плотность клеточной популяции - концентрация клеток в 1 мл суспензии.

Минимальное время удвоения клеточной популяции в накопительной суспензионной культуре. Например, время клеточного удвоения для сахарной свеклы составляет 86 часов, табака - 48 часов, фасоли - 22 часа.

Вес сырого вещества суспензии определяют после помещения ее на предварительно взвешенный фильтр из нейлоновой ткани и промывания водой для удаления остатков питательной среды.

Вес сухого вещества определяют после просушивания определенной навески сырой биомассы при 60-70 °С в течение суток.

Количество клеток. Чтобы установить количество клеток в определенном объеме суспензии, необходимо диспергировать ее содержимое до одноклеточного состояния обработкой 5-10% хромовой кислотой. Подсчет клеток проводят, используя 1 мл одноклеточной суспензии, нанесенный на сетку счетной камеры.

Размер клеток определяют их измерением под микроскопом с помощью шкалы окуляр-микрометра.

Жизнеспособность культуры определяют соотношением количества жизнеспособных клеток к общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при

29

окрашивании препаратов красителями: 0,5 %-ным раствором синей Эванса или 0,01 %-ным раствором флуоресцеив-ацетата.

Во многих случаях изучение особенностей размножения и роста клеток связано с необходимостью использования синхронизированных клеточных популяций.

Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, например, пониженной температурой, или химических соединений.

Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК - тимидин, 5- аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл продолжается только до G1-периода, и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.

Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накапливаются в G1 или С2-периоде клеточного цикла.

Затем пассирование суспензии на среду с недостающим компонентом приводит к синхронизации клеточного деления.

С помощью индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотический индекс с 2-3 % до 30-35 %.

Фазы ростового цикла в периодическом суспензионной культуре.

Ростовой цикл, или цикл выращивания - это период от помеще-

ния инокулюма (части суспензионной культуры) на свежую среду до следующего субкультивирования.

30

Суспензионная культура представляет собой популяцию отдельных клеток и небольших клеточных агрегатов, которые, в свою очередь, являются субпопуляциями, состоящими из несколькихклеток.

Несмотря на морфологическую и физиологическую гетерогенность внутри популяции, рост клеточных культур описывается одно- значноS-образнойкривой(рис.1).

Рис. 1. Ростклеточной популяцииприкультивированиивнакопительном режиме: 1 - латентная фаза; 2 - экспоненциальная фаза; 3 - линейная фаза роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза

Различают следующие фазы ростового цикла:

Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. Это огра-

ниченный период в ростовом цикле периодической (накопительной) культуры, в ходе которого происходит экспоненциальное (логарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления, и как следствие - увеличение сухого вещества.

Различают раннюю и позднюю экспоненциальные фазы. В течение ранней экспоненциальной фазы наблюдается ряд цитологических изменений: в клетках исчезает большая вакуоль, происходит увеличение объема цитоплазмы, увеличивается число полирибосом и митохондрий. Наряду с цитологическими изменениями

31

имеет место и активация клеточного метаболизма: увеличивается содержание РНК, белка, ДНК, интенсивность поглощения кислорода. Все эти процессы приводят к активному делению клеток и образованию клеточных агрегатов.

Втечение поздней экспоненциальной фазы роста суспензионной культуры наблюдается замедление клеточного деления, но происходит увеличение размера клеток. Таким образом, увеличение биомассы в этот период происходит в основном за счет растяжения клеток.

Линейная фаза очень короткая. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянная.

Фаза замедления роста (ранняя стационарная фаза). В этот период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечается гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных веществ.

Стационарная фаза. К этому периоду ростового цикла суспензионная культура достигает максимума сухого веса. В культуральной среде накапливаются продукты жизнедеятельности клеток, угнетающие рост культуры. Культуральная среда истощается по наличию основных компонентов, обеспечивающих азотное, фосфорное, углеводное питание. С тем чтобы не наступила гибель клеток, необходимо субкультивирование суспензионной культуры на свежую среду.

Всреднем от начала культивирования до стационарной фазы роста проходит 21 -28 дней.

Продолжительность ростового цикла зависит от условий культивирования, исходной плотности, возраста инокулюма, состава и объема питательной среды, видоспецифичности исходной культуры.

32

Непрерывное культивирование

Другой метод выращивания клеточных культур - непрерывное культивирование - основан на поддержании баланса между разбавлением питательной среды и удалением части суспензии.

Установлено, что если при периодическом культивировании клеточных суспензий в экспоненциальной фазе роста в культуральную систему добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное культивирование.

Культуральные системы, функционирующие непрерывно,

разделяют на полупроточные и проточные.

При полупроточном режиме выращивания через определен-

ные интервалы времени производится отбор части суспензии и разбавление оставшейся суспензии свежей средой. Через суспензию пропускают стерильный воздух. Культуру перемешивают с помощью магнитной мешалки. Культивирование может продолжаться в течение нескольких месяцев.

Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры (культуральные сосуды) могут функционировать в течение нескольких лет. Ферментеры, используемые для производства больших клеточных биомасс, могут достигать объема до 1500 л. Для осуществления многостадийных процессов при промышленном культивировании клеток-продуцентов веществ вторичного обмена используют конструкции, состоящие из системы нескольких ферментеров.

3. РАСТЕНИЯ И ИХ КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ КАК ПРОМЫШЛЕННЫЕ ИСТОЧНИКИ БАВ

33

3.1. Растения.

Растения являются продуцентами многих БАВ – соединений, способных оказывать слияние на биологические процессы в организме. К таким соединениям принадлежат сердечные гликозиды, сапонины, стерины, каратиноиды, полифенолы, алкалоиды, витамины, хиноны, а также вещества, обладающие специфическим ароматом, вкусом и окраской.

Биологически активные вещества принадлежат к продуктам вторичного обмена, которые называют вторичными метаболитами или вторичными продуктами биосинтеза. В настоящее время известно более 100 000 вторичных метаболитов, продуцируемых растениями. Многие из них являются практически, экономически важными продуктами и используются в фармакологической, косметической, пищевой промышленности. (табл.3)

Лекарственные препараты составляют основную статью расхода веществ растительного происхождения, но скорее, в финан-

34

совом отношении, чем по объему. Лекарственные растения все еще вносят значительный вклад в фармацевтическую промышленность, составляя около 25% важнейших лекарственных средств. В табл. 4 приведены сведения о 10 основных лекарственных препаратах, их происхождении и клиническом действии. Это вещества не только самых разнообразных химических форм, но и широкого спектра терапевтического действия.

Таблица 4

Десять наиболее употребляемых лекарственных веществ, получаемых из растений

К лекарственным веществам примыкают наркотики и стимулирующие вещества. Наркотики являются промежуточным звеном между ядами и лекарственными препаратами. В небольших количествах они часто являются эффективными лекарствами, например морфий. При высоких концентрациях или при постоянном применении они могут стать причиной пагубного влечения (наркомании) или смерти. Они представляют собой основную группу запрещенных натуральных продуктов. Наиболее известными являются марихуана (или гашиш) из Cannabis, опиум и героин из Papaver som-

35

niferum и кокаин Erythroxylon. Табак тоже принадлежит к этой группе, поскольку содержит никотин.

Стимуляторы – отличные от наркотиков вещества и в целом не вредны. Чаще всего применяют кофеин или связанные с ним теобромин, используя в виде напитков. Кофеин найден во многих растениях, из которых наиболее известны Camellia sinensis (чай) и Coffea arabica (кофе).

Яды – вероятно, крайнее лекарственное средство. Нейротоксические яды растений все еще используют охотники в Африке и Южной Америке, например, яд кураре. Многие растительные яды обладают сильным нейротоксическим действием, например, рицин из клещевины обыкновенной.

Химикаты, применяемые в сельском хозяйстве. Помимо регуляторов роста растений наиболее выдающимся событием было открытие пиретринов. Перетрины, выделяемые из цветков Chrysanthemum cinerariacfolium, являются мощными инсектицидами (уничтожающие насекомых). С природными пиретринами конкурируют синтетические, однако, при применении последних появляется устойчивость к ним у насекомых, а также возникает кумулятивная токсичность.

Тонкие химические соединения. «Тонкие химикаты» - это общее название веществ, применяемых в качестве добавок для духов, а также вкусовые ароматические вещества, красители пищевых продуктов. Это и очень дорогие, выпускаемые в небольших количествах вещества и дешевые препараты, производимые десятками тысяч тонн. Например, жасминовая эссенция.стоит в США 6000 долларов за 1 кг и производится в объеме лишь 20-30 кг в год, а масло какао, основной компонент шоколада, стоимостью 4 доллара за 1 кг производится в объеме 20 000 т в год. Вещества варьируют от простых соединений типа хинина до сложных смесей типа эфирных масел. Последние представляют собой типичные монотерпены, часто летучие соединения, составляющие основу промышленности, производящей ароматические соединения – отрасли, создающие ценные и дорогостоящие продукты.

36

Следует отметить все возрастающий интерес промышленности к миру растений как к источнику химических соединений. Разработка нового синтетического лекарственного препарата обходится примерно в 100 млн. американских долларов и занимает в 10 лет, поэтому нетрудно понять возобновляющейся интерес к растениям как «фабрикам» для их синтеза.

3.2 Культура изолированных клеток и тканей растений.

Культуры клеток и тканей, полученные in vitro, как и клетки интактного растения, могут синтезировать вторичные метаболиты, которые могут иметь большое практическое значение. Причем по качественному составу и количественному составу они могут схожи.

Культуры клеток и тканей можно использовать для получения природных веществ растительного происхождения следующими способами:

-новые пути синтеза уже известных веществ, например кодеина, хинина, пиретроинов;

-синтез новых продуктов из тех растений, которые трудно выращивать или внедрять, например тебаин из Papaver bracteatum;

-использование культуры клеток как источника совершено новых веществ, например, рутакультин из культур Ruta;

-использование культуры клеток в качестве систем для биотрансформации: как самого процесса с получением конеч-

ного продукта, так и отдельного звена химического процесса, например при синтезе дигоксина.

Практически важные результаты использования культуры клеток и тканей были получены в 60-х годах ХХ века. Было показано, что такие практически важные БАВ как диосгенин, гармин и виснагин синтезируются культурами клеток в тех же количествах, как в исходном растении.

Скрининг, проведенные среди большого количества растений показал, что, во-первых, круг БАВ, синтезируемых в культурах,

свидетельствует об огромном синтетическом потенциале и разнообразии вторичного метаболизма; во-вторых, относительно небольшое число их пригодно для использования в промышленности. К тому же, определенной трудностью биосинтеза является то, что во многих системах растений вторичные метаболиты накапливаются в значительных количествах на стационарной фазе роста; в физиологическом плане биосинтез БАВ связан с морфологическим развитием растения, с формированием дифференцированных тканей.

Внастоящее время собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств синтезирующие вторичные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный – источник диосгенина, диоскорея дельтовидная – стероидные гликозиды, равольфия змеиная – продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д. Установлено недавно, что клетки тиса ягодного синтезирует веще- ство-таксон, которое является антираковым препаратом.

Осуществляются большие научно-технологические исследования по культивированию клеток и тканей растений in vitro.

Прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Биомасса клеток женьшеня

всуспензии при выращивании в 50 литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем выращивании на плантации.

Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного корня стоит 100-150 дол. США; цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов США) биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма привлекателен.

Втаб. 5 приведены некоторые экономически важные продукты, синтез которых получен в культуре клеток высших растений.

Таблица 5

Экономически важные продукты, полученные в культуре клеток высших растений (по Р.Г. Бутенко, 1999)

4. ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРОИЗВОДСТВО БАВ ИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

В основе промышленного производства БАВ (лекарственный субстанций и др.) из культуры клеток растений лежит ряд последовательных стадий и операций: получение высокопродуктивных продуцентов, разработка оптимальных условий культивирования продуцента БАВ с максимальным биосинтезом целевого продукта, разработка и внедрение в практику соответствующих методов и условий выделения и очистки БАВ, создание готовых препаратов и контроль качества. Работа на каждом из этих этапов должны проводится соответствующими специалистами: биотехнологами, генетиками, химиками-технолагами (Чуешов и др., 2002).

4.1 Подготовка среды для культивирования продуцента и посевного материала (первая стадия).

39

Для каждого продуцента БАВ, для каждого вновь образуемого каллуса и суспензионной культуры растений разрабатывается своя оптимальная среда, которая должна отвечать следующим основным требованиям:

1)обеспечивать хороший рост биомассы и максимально возможное образование целевого продукта – алкалоидов, гликозидов, полисахаридов и др. продуктов вторичного синтеза;

2)содержать доступные по стоимости компоненты;

3)обеспечивать применение наиболее экономических и эффективных приемов выделения и очистки БАВ.

Среды Мурасиге-Скуча (МС) и Шенке-Хильдебрандта (ШХ) относятся к наиболее употребляемым в работе с культурами клеток растений и оказались эффективными для роста различных одно- и двудольных растений (табл. 2). Их считают средами с высоким содержанием солей (по сравнению с низкосолевой средой Уайта). Среда ШХ от других сред отличается очень высоким, десятикратным содержанием мезоинозината. Среди МС и ШХ содержат железо в хелатированной форме в комплексе с ЭДТА. Это обеспечивает его доступность при рН до 8,0 в течение всего периода роста культуры, тогда как при отсутствии хелатирующего агента недостаток железа может проявиться очень быстро.

Компоненты среды для выращивания каллусных и суспензионных культур можно разделить на шесть групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных растворов:

1)основные неорганические питательные вещества (макроэлементы);

2)микроэлементы

3)источники железа;

4)органические добавки (витамины);

5)источники углерода;

6)регуляторы роста растений.

Вреактор с мешалкой с помощью вакуума вносят поочередно приготовляемые растворы, соблюдая следующий порядок:

40

-раствор макросолей;

-агарированный раствор;

-раствор хелата железа;

-раствор микроэлементов;

-раствор кальция, нитрата;

-раствор сахара.

Смеси тщательно перемешивают в течение 5 мин., затем 1-2 мин ведут вертикальное перемешивание путем барботажа при включенной мешалке. Обязательно отбирают контрольные пробы для опредления рН среды (рН должно быть в пределах 5,0-6,2; температура раствора (22 ± 2,5°С).

В промышленных условиях стерилизация питательных сред осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.

Периодический метод стерилизации применяют при использовании небольших объемов среды. Он заключается в том, что среда, нагретая до определенной температуры (120-125°С) непосредственно в ферментаторах или в специальных паровых стерилизаторах ГПСД-1700, выдерживается при этой температуре в течение 30-60 мин (в заивисимости от объема среды или от её состава, после чего охлаждается до 27-30°С).

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускается острый пар (давление пара около 5 атм.). Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и быстро её нагревает. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.

Нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (около 125°С), среда поступает в специальный аппарат – выдерживатель, где она выдерживается при температуре 120125°С. время выдерживания зависит от состава среды и составляет 5-10 мин. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змееви-

41

ковый холодильник.здесь она охлаждается до 30-35°С (на выходе) и поступает в ферментатор. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды.

Подготовка посевного материала – одна из ответственных операций в цикле биологического методы получения БАВ из культуры тканей.

Культуру ткани (коллекцию культуры) заводы получают из академий и университетов. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии, характеристики среды для культивирования и хранения.

Для твердофазного метода культуру ткани выращивают на агаризованной стерильной питательной среде в колбах вместимостью 0,25 л в термостатируемом помещении или термостате с температурой 27±1°С. на 38-46 сут. Роста ткань материнской культуры режут ткаим образом, чтобы инокулюм состоял из вертикального столба (верхний слой, средний и часть нижнего слоя безагаризованной среды). Нельзя допускать воздействия на культуру дезсредств, бактерицидных ламп, так как это приводит к инактивации роста. Из материнской культуры пересаживают 7-9 дочерних культур и через 38-46 сут. Роста в термостатируемом помещении отбирают колбы с культурами тканей лучших ростовых признаков. Для таких культур характерен быстрый рост, максимальное использование питательной среды, цвет ткани от светло-желтого до молочного, отсутствие некротических включений.

Для глубинного (суспензионного) метода культуру ткани предварительно выращивают на агаризованной стерильной среде в пробирках, затем из пробирок высеивают в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации глубинного выращивания на качалках в течение 38-46 сут. для каждой генерации. Из второй генерации культуры (в колбе) делают посев в небольшой (10 л) инокулятор, а затем хорошо развивающуюся культуру пере-

42