Volume1
.pdf
208 Часть 1. Введение в мир клетки
Рис. 3.13. Сравнение ДНК-связывающих доменов (из класса так называемых гомеодоменов) в паре белков из двух организмов, разошедшихся на эволюционном пути более миллиарда лет назад.
а) Ленточная модель структуры, одинаковая у обоих белков. б) Контур позиций атомов α-углерода. Изображенные здесь трехмерные структуры определены рентгеноструктурным анализом белка α2 дрожжей (зеленый) и белка engrailed дрозофилы (красный). в) Сравнение аминокислотных последовательностей областей белков, показанных на видах а и б. Черными точками отмечены участки, содержащие идентичные аминокислоты. Оранжевыми точками обозначены позиции вставки из трех аминокислотвбелкеα2.(ПереработанонаосновеC. Wolbergeretal.,Cell67:517–528,1991.Сразрешения издательстваElsevier.)
отдельные организмы, производящие их, оказывались в достаточно невыгодном положении, не позволяющем им пройти естественный отбор.
Семейства белков легко опознаются при секвенировании генома любого организма; например, определение последовательности ДНК полного генома человека показало, что у каждого из нас около 24 000 белок-кодирующих генов. Путем сравнения последовательностей мы можем приписать продукты приблизительно 40 процентов этих генов известным белковым структурам, относящимся больше чем к 500 различным семействам белков. В основной массе, белки в каждом семействе эволюционировали таким образом, что стали выполнять немного разные функции, как например, в случае ферментов эластазы и химотрипсина, представленных ранее на рис. 3.12. Такие белки иногда называют паралогами, дабы отличить их от соответствующих белков в разных организмах (ортологов, таких как эластазы мыши и человека).
Как описано в главе 8, благодаря появлению методов рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР), мы теперь знаем трехмерные структуры, или конформации, более 20 000 белков. Путем тщательного сравнения конформаций этих белков «структурные биологи» (то есть специалисты в области структуры биологических молекул) установили, что существует ограниченное число способов укладки белковых доменов — возможно, не более 2 000. К настоящему времени определены приблизительно 800 видов укладки белковых цепей. Среди этих известных укладок преимущественно встречаются те, что наиболее распространены в мире белковых структур: например, почти для трех четвертей семейств доменов с предсказанными структурами характерны всего 50 видов укладки полипептидных цепей. Поэтому можно надеяться, что полный каталог наиболее важных белковых укладок, которые существуют в живых организмах, будет в пределах нашей досягаемости.
Глава 3. Белки 209
3.1.7. По аминокислотным последовательностям можно выявить близкородственные белки
Существующая база данных известных белковых последовательностей содержит более десяти миллионов записей, и их число растет очень быстро, по мере того, как все больше и больше геномов проходит операцию секвенирования — и открывает нам мириады новых генов, кодирующих белки. В распоряжении ученых имеются мощные программы компьютерного поиска, которые позволяют им сравнивать любой недавно открытый белок со всей этой базой данных с целью поиска его возможных родственников. Многие белки, гены которых эволюционировали от общего предка, могут быть идентифицированы на основании статистически значимых подобий в последовательностях аминокислот.
Ввиду столь великого числа белков в базе данных программы поиска находят много незначимых совпадений, обусловливающих такой уровень фонового шума, при котором становится очень трудно распознать все родственные белки, кроме наиболее близких. Вообще говоря, для того, чтобы сопоставить два белка, необходима 30 %-я идентичность их последовательностей. Однако нам известны функции многих коротких опознавательных, или сигнатурных, последовательностей («отпечатков пальцев»), и это широко используется для установления более отдаленных связей (рис. 3.14).
Рис.3.14.Употреблениекороткихсигнатурныхпоследовательностейдляпоискародственныхбелковых доменов.Двекороткиепоследовательностидлиной15и9аминокислот,отмеченныезеленымфоном, могут быть использованы для поиска в крупных базах данных домена, который встречается во многих белках,аименнодомена SH2.Здесьприведено сравнениепервых50из100аминокислотдоменаSH2 вбелкахSrcчеловекаидрозофилы(см.рис.3.10).Впостроенныхкомпьютеромвыровненныхпоследовательностях (желтая строка) точные совпадения между белками человека и дрозофилы отмечены однобуквенными обозначениями соответствующих аминокислот; позиции с подобными, но не тождественными аминокислотами обозначены знаком +, а в местах несовпадений оставлены пропуски. На этой схеме везде, где один или оба белка содержат точное совпадение с позициями в зеленых последовательностях,обевыровненныепоследовательностиокрашеныкрасным.
Сравнительный анализ белков важен потому, что родственные структуры часто подразумевают схожие функции. Если удастся обнаружить, что аминокислотная последовательность нового белка имеет сходство с белком, функция которого известна, то на этом можно сэкономить многие годы экспериментирования. По родству последовательностей, например, впервые узнали, что определенные гены, которые ассоциированы со злокачественной трансформацией клеток млекопитающих, кодируют протеинкиназы. Подобным же образом удалось быстро определить, что многие белки, которые управляют закладкой общего строения организма в ходе эмбрионального развития плодовой мушки дрозофилы, являются регуляторными белками.
210 Часть 1. Введение в мир клетки
3.1.8. Некоторые белковые домены служат составными частями множества различных белков
Как утверждалось ранее, большинство белков состоит из ряда доменов, где различные области полипептидной цепи свернулись независимо от других областей
иобразовали компактные структуры. Такие многодоменные белки, как полагают, произошли от случайного соединения последовательностей ДНК, кодирующих эти домены, что обусловило появление нового гена. В местах соприкосновения доменов часто создавались новые поверхности связывания, и многие функциональные участки, где
ипроисходит связывание маленьких молекул, как оказалось, расположены именно там. В ходе эволюционного процесса, названного перетасовкой доменов, многие крупные белки появились как новые сочетания уже существующих доменов (рис. 3.15).
Рис. 3.15. Перетасовка доменов. В ходе эволюции белка происходила серьезная перетасовка блоков белковойпоследовательности(белковыхдоменов).Течастибелка,которыенаэтойсхемепредставлены одинаковойформойиодинаковымцветом,являютсяэволюционнородственными.Сериновыепротеазы, подобнохимотрипсину,образованыиздвухдоменов(коричневые).Востальныхтрехпоказанныхпротеазах,сболеевысокимиуровнямирегуляциииспециализации,этидвапротеазныхдоменасоединены соднимилинесколькимидоменами,которыеподобныобнаруженнымвэпидермальномфакторероста (EGF;зеленые),скальций-связывающимбелком(желтый)илисдоменомkringle2 (синий),которыйсодержиттривнутреннихдисульфидныхмостика.Химотрипсинпоказаннарис.3.12.
Одна подгруппа белковых доменов была особенно подвижной в ходе эволюции; они, как кажется, имеют особенно универсальные структуры и упоминаются иногда как белковые модули. Структура одного такого модуля, домена SH2, показана в приложении 3.2 (стр. 200–201). Некоторые другие из этих «вездесущих» белковых доменов представлены на рис. 3.16.
У каждого из доменов есть стабильная внутренняя структура, или сердцевина, называемая «кор» (от английского «core»), которая образована из цепей β-листа с выступающими менее упорядоченными петлями полипептидной цепи (окрашены зеленым). Такие петли имеют идеальное расположение для формирования участков связывания других молекул, что наиболее ясно видно при рассмотрении укладки цепей иммуноглобулина, которые образуют основание молекулы антитела
2 Крис Крингл — тайное имя Санта Клауса, известного также как Дед Мороз (искаженное нем. Christ Kindlein — «Христос-младенец»). — Прим. пер.
Глава 3. Белки 211
Рис. 3.16. Трехмерные структуры некоторых белковых модулей. В представленных здесь ленточных моделях цепи β-листов изображены в виде стрелок, а N- и C-концы обозначены красными кружками.
(ПерерисованоизM. Baron,D. G. NormanandI. D. Campbell,TrendsBiochem.Sci.16:13–17,1991,сразрешения издательстваElsevier,иD. J. Leahyetal.,Science258:987–991,1992,сразрешенияиздательстваAAAS).
(см. рис. 3.41). По всей вероятности, такие домены из β-листов достигли вершин эволюционного успеха потому, что их структура обеспечивает удобную основу для создания новых участков связывания лигандов посредством незначительных изменений в хитросплетении выдающихся из них петель.
Вторая особенность этих белковых доменов, которая объясняет их практичность,— это простой способ встраивания в другие белки. В пяти из шести доменов, помещенных на рис. 3.16, N- и C-концы находятся на противоположных полюсах домена. Когда ДНК, кодирующая такой домен, подвергается тандемной дупликации, что совсем не считается необычным в эволюции геномов (обсуждается в главе 4), дублированные модули с таким расположением «в линию» могут быть легко соединены в серии протяженных структур — как из множества своих копий-дубликатов, так и в сочетании с другими выстроенными в линию доменами (рис. 3.17). Жесткие удлиненные структуры, состоящие из ряда доменов, особенно многочисленны в молекулах внеклеточного матрикса и во внеклеточных частях белков – рецепторов клеточной поверхности. Другие
212 Часть 1. Введение в мир клетки
Рис. 3.17. Протяженная структура, состоящая из ряда соединенных в линию белковых модулей. Четыре мо-
дуля 3-го типа (см. рис. 3.16) молекулы фибронектина внеклеточногоматриксапредставленынасхемеаввиде ленточной модели, а на схеме б — в виде объемной модели. (Переработано из статьи D. J. Leahy, I. Aukhil and H. P. Erickson, Cell 84: 155–164, 1996. С разрешения из-
дательстваElsevier.)
модули, в том числе домен SH2 и домен kringle, представленный на рис. 3.16, относятся к «plugin» (вставному) типу, при этом их N- и C-концы расположены поблизости друг от друга. После перестроек генома такие модули обычно находят себе место для встраивания в петельную область второго белка.
Сравнение относительной частоты встречаемости доменов у различных эукариот показывает, что для многих распространенных доменов, таких как протеинкиназы, эта частота схожа для таких столь разнящихся между собой организмов, как дрожжи, растения, черви, мухи и человек (рис. 3.18). Но есть некоторые достойные интереса исключения, как например, антиген-узнающий домен главного комплекса гистосовместимости (MHC, Major Histocompatibility Complex) (см. рис. 25.52),
который у человека присутствует в 57 копиях, но в остальных только что упомянутых четырех организмах отсутствует. Такие домены предположительно имеют специализированные
функции, которыми не наделены другие эукариоты, и в ходе эволюции были подвергнуты строгому отбору, с тем чтобы дать начало множеству копий. Подобным же образом можно допустить, что домен наподобие SH2, с необычайно высоким уровнем частотности в организмах высших эукариот, особенно важен для многоклеточного организма (сравните многоклеточные организмы с дрожжами на рис. 3.18).
3.1.9. Определенные пары доменов встречаются во многих белках
Мы можем составить большую таблицу, показывающую степень используемости доменов во всех организмах, последовательности геномов которых известны. Например, геном человека, согласно оценкам, содержит около 1 000 доменов иммуноглобулина, 500 доменов протеинкиназы, 250 ДНК-связывающих гомеодоменов, 300 доменов SH3 и 120 доменов SH2. Важная дополнительная информация может быть получена при сравнении частоты встречаемости и расположения доменов в более чем 100 геномах эукариот, бактерий и архей, которые полностью секвенированы. Например, мы находим, что более чем две трети белков состоят из двух и более доменов, и что одни и те же пары доменов неоднократно встречаются в одинаковом взаимном расположении в белке. Хотя половина всех семейств доменов есть у архей, бактерий и эукариот, только около 5 % двудоменных сочетаний являются общими
Глава 3. Белки 213
Рис.3.18.Относительнаячастотавстречаемоститрехбелковыхдоменовворганизмахпятиэукариот.
Приведенныездесьприблизительныеданныерассчитаныкакчастноеотделениячислакопийкаждого доменанаобщеечислобелков,кодируемыхкаждымизорганизмов,чтоустановленопопоследовательностиихгеномов.Такимобразом,длядоменовSH2ворганизмечеловекаимеем120/24 000=0,005.
для всех этих групп организмов. Такая закономерность позволяет предположить, что большинство белков, содержащих особенно важные двудоменные сочетания, возникло на сравнительно поздних этапах эволюции.
200 самых распространенных двудоменных сочетаний встречаются примерно у одной четверти всех белков, домены которых есть в полной базе данных. Поэтому было бы очень полезно определить точную трехмерную структуру по крайней мере одного белка для каждого общего двудоменного сочетания, с тем чтобы показать, как эти домены взаимодействуют в белковых структурах соответствующих типов.
3.1.10. Геном человека кодирует сложный набор белков и являет нам многое, что остается еще непонятым
Результаты секвенирования генома человека оказались удивительными, потому что они показали, что наши хромосомы содержат всего лишь около 25 000 генов. Если судить только по числу генов, то может показаться, что мы устроены не сложнее, чем крошечный сорняк, арабидопсис, и только в 1,3 раза сложнее червя нематоды. Последовательности геномов показывают также, что позвоночные унаследовали почти все свои белковые домены от беспозвоночных, и только 7 процентов идентифицированных доменов человека являются специфичными для позвоночных.
Однако в среднем, все наши белки организованы сложнее (рис. 3.19). Перетасовка доменов во время эволюции позвоночных обусловила появление многих новых комбинаций белковых доменов, так что в итоге в белках человека встречается почти вдвое больше сочетаний доменов, чем в белках червя или мухи. Так, напри-
214 Часть 1. Введение в мир клетки
Рис.3.19.Доменнаяструктурагруппыэволюционно родственных белков с предположительно сходными функциями. Вообще, для бел-
ков наиболее сложных организмов, таких как человек, характерно наличие дополнительных доменов — как в случае сравниваемого здесь ДНК-связывающегобелка.
мер, в белках человека домен трипсинподобной сериновой протеазы связан с белковыми доменами по крайней мере
18-ти типов, тогда как у червя, как известно, он ковалентно связывается лишь с 5-ю различными доменами. Это
дополнительное разнообразие в наших белках значительно увеличивает диапазон возможных межбелковых взаимодействий (см. рис. 3.82), однако не известно, способствует ли оно сколько-нибудь развитию в нас человеческой сущности.
Сложность живых организмов ошеломляет, и весьма отрезвляюще звучит тот факт, что мы в настоящее время не имеем даже самого отдаленного представления о возможных функциях более чем 10 000 белков, которые к настоящему времени идентифицированы в геноме человека. Несомненно, следующему поколению клеточных биологов предстоит разгадать множество завораживающих таинств природы, которые она являет в избытке.
3.1.11. Крупные белковые молекулы часто содержат более одной полипептидной цепи
Те же слабые нековалентные связи, которые придают белковой цепи специфическую конформацию, позволяют белкам также связываться друг с другом и образовывать в клетке внушительные структуры. Любую область поверхности белка, которая может взаимодействовать с другой молекулой за счет образования нековалентных связей, называют участком связывания, или сайтом связывания (binding site).
Белок может содержать участки связывания различных больших и малых молекул. Если некоторый участок связывания узнает поверхность какого-либо второго белка, то прочное связывание двух свернутых полипептидных цепей в этом участке приводит к образованию более крупной молекулы белка с точно заданной геометрией. Все полипептидные цепи в таком белке называют белковыми субъединицами.
В простейшем случае две одинаково свернутые полипептидные цепи связываются друг с другом в расположении «лицом к лицу», образуя симметричный комплекс из двух белковых субъединиц (димер), скрепляемый воедино за счет взаимодействий между двумя идентичными участками связывания. Примером служит Cro-репрессор бактериофага лямбда — регуляторный белок, который связываясь с ДНК, выключает экспрессию некоторых вирусных генов в зараженной бактериальной клетке (рис. 3.20). Клетки содержат множество других типов симметричных белковых комплексов, образованных из многочисленных копий одной полипептидной цепи. Например, фермент нейраминидаза состоит из четырех одинаковых белковых субъединиц, соединенных друг с другом по принципу «голова к хвосту» в замкнутое кольцо (рис. 3.21).
Глава 3. Белки 215
Рис.3.20.Двеидентичныебелковыесубъединицысвязываютсявместесобразованиемсимметричного белковогодимера.БелокCro-репрессорбактериофагалямбдасвязываетсясДНК,чтобы«выключить» определенные гены вируса. Две идентичные субъединицы этого белка связаны «голова к голове» и скреплены воедино за счет комбинации гидрофобных сил (синих) и водородных связей (желтая
область). (Переработано из D. H. Ohlendorf, D. E. Tronrud, B. W. Matthews, J. Мol. Biol. 280: 129–136, 1998. СразрешенияAcademicPress.)
Рис. 3.21. Молекула белка, состоящая из несколький копий одной белковой субъединицы. Фермент нейраминидазапохожнакольцо,составленноеизчетыреходинаковыхполипептидныхцепей,каждая из которых образована из шести повторов четырехцепочечного β-листа, что изображено цветными стрелками. На маленькой схеме показано, за счет каких мотивов происходит взаимодействие между субъединицамисобразованиемданнойструктуры.
216 Часть 1. Введение в мир клетки
Рис.3.22.Белок,образуемыйврезультатесимметричнойсборки двух различных субъединиц. Гемоглобин — белок, в боль-
шом количестве содержащийся в красных кровяных тельцах и состоящий из двух копий α-глобина и двух копий β-глобина. Каждая из этих четырех полипептидных цепей содержит молекулу гема (показана красным), которая является участком связывания кислорода (O2). Таким образом, каждая молекула гемоглобинавкровипереноситчетыремолекулыкислорода.
Многие белки в клетках содержат полипептидные цепи двух и более типов. Гемоглобин — белок, обратимо связывающий кислород и содержащийся в красных кровяных тельцах, — состоит из двух одинаковых субъединиц α-глобина и двух одина-
ковых субъединиц β-глобина, симметрично расположенных друг относительно друга (рис. 3.22). Такие многосубъединичные белки содержатся в клетках в большом количестве и могут быть огромных размеров. На рис. 3.23 представлен ряд белков, структуры которых установлены, для сравнения их по размеру и форме – от нескольких больших белков до нескольких относительно малых, с моделями которых мы уже знакомили читателя.
3.1.12. Некоторые белки образуют длинные спиралевидные нити
Некоторые белковые молекулы собираются в филаменты (нити), которые могут простираться по всей длине клетки. Проще всего длинная цепь одинаковых белковых молекул может быть построена, если каждая молекула имеет участок связывания, комплементарный другой области поверхности той же молекулы (рис. 3.24). Например, актиновый филамент представляет собой длинную спиральную структуру, образованную двумя молекулами белка актина (рис. 3.25). Клетки эукариот очень богаты актином, который формирует в них одну из главных систем филаментов клеточного скелета (рассмотрим в главе 16).
Почему спираль заняла столь видное место в сонме биологических структур? Как мы могли убедиться, биологические структуры часто образуются путем связывания подобных субъединиц — таких как аминокислоты или белковые молекулы — в длинные повторяющиеся цепи. Если все субъединицы одинаковы, то соседние субъединицы в цепи чаще всего могут подходить одна к другой лишь одним способом, при котором их относительные положения подогнаны так, что свободная энергия контакта между ними минимальна. В силу этого все субъединицы располагаются друг относительно друга в точности одним и тем же образом, так что субъединица 3 пригнана к субъединице 2 тем же способом, что и субъединица 2 к субъединице 1, и так далее. Поскольку субъединицы соединяются в прямую линию очень редко, такой тип сборки обычно дает спираль — регулярную структуру, напоминающую собой винтовую лестницу, что наглядно показано на рис. 3.26. В зависимости от направления закручивания спираль, как говорят, бывает правой или левой (см. рис. 3.26, д). При перевертывании спирали вверх тормашками направление ее вращения не изменяется, но при зеркальном отражении спирали оно меняется на противоположное.
Спирали присутствуют в биологических структурах очень часто, будь субъединицы маленькими молекулами, соединенными друг с другом ковалентными связями (напри-
Глава 3. Белки 217
Рис. 3.23. Молекулы белков в одном масштабе. Сравнения ради показана молекула ДНК, связанная с белком. Эти объемные модели приведены для того, чтобы можно было представить многообразие размеров и форм белков. Гемоглобин, каталаза, порин, алкогольдегидрогеназа и аспартаттранскарбамоилазасостоятизмножествакопийсубъединиц.ДоменSH2(влевомверхнемуглу)изображенвовсех подробностяхвприложении3.2(стр.200–201).(ЗаимствованоспереработкойизDavidS. Goodsell,Our MolecularNature.NewYork:Springer-Verlag,1996.СразрешенияSpringerScienceandBusinessMedia.)